Генная инженерия растений лабораторное руководство в

Show simple item record

Files in this item

This item appears in the following Collection(s)

• Libgen [81666]

Show simple item record

Оглавление:

Обложка книги.

Предисловие редактора перевода [5]
Предисловие [6]
Список авторов [8]
Список сокращений [8]
Глава 1. Агробактериальные трансформирующие векторы растений. Ф. Армитидж, Р. Уолден, Дж. Дрейпер [11]
  1.1. Введение [11]
    1.1.1. Индукция опухолей агробактерий [11]
    1.1.2. Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens [13]
    1.1.3. Ri-плазмиды Agrobacterium rhizogenes [14]
    1.1.4. Механизм переноса Т-ДНК [15]
    1.1.5. Плазмиды агробактерий как векторы для трансформации [17]
    1.1.6. Основные компоненты неонкогенных Ti-плазмидных векторов [18]
    1.1.7. Неонкогенные векторы общего назначения на основе Ti-плазмид, используемые для трансформации растений [18]
    1.1.8. Векторы для трансформации растений с помощью A. rhizogenes [26]
    1.1.9. Использование специальных трансформирующих векторов на основе Ti-плазмид [27]
    1.1.10. Выбор Ti-плазмидной векторной системы агробактерий [29]
    1.1.11. Клонирование в векторах для трансформации растений [35]
  1.2. Общие молекулярно-биологические рекомендации [37]
  1.3. Культивирование и хранение бактериальных штаммов [39]
    1.3.1. Обеспечение [39]
    1.3.2. Наращивание ночных бактериальных культур [40]
    1.3.3. Рассев бактериальных культур для получения отдельных колоний [40]
    1.3.4. Длительное хранение бактериальных штаммов [41]
    1.3.5. Приготовление чашек для селекции бактерий [41]
  1.4. Препаративное выделение плазмид из Е. coli в больших объемах [42]
    1.4.1. Основные положения [42]
  1.5. Выделение и очистка рестрикциоиных фрагментов ДНК для лигирования [49]
    1.5.1. Основные положения [49]
    1.5.2. Очистка фрагментов ДНК после гидролиза рестриктазами [49]
    1.5.3. Удаление 5′-фосфатных групп фрагментов ДНК с помощью фосфатазы из кишечника теленка [50]
    1.5.4. Электроэлюция рестрикциоииых фрагментов из агарозных гелей [51]
    1.5.5. Очистка специфических рестрикционных фрагментов путем фильтрования центрифугированием [53]
  1.6. Лигирование фрагментов ДНК с векторами для трансформации растений [54]
    1.6.1. Основные положения [54]
    1.6.2. Обеспечение [58]
    1.6.3. Методика (модифицировано по [39]) [59]
  1.7. Введение рекомбииаитиых плазмид в клетки Е. coli с помощью трансформации [61]
    1.7.1. Основные положения [61]
    1.7.2. Обеспечение [63]
    1.7.3. Методика [64]
  1.8. Быстрое выделение небольших количеств плазмидной ДНК Е. coli [67]
    1.8.1. Основные положения [67]
    1.8.2. Обеспечение [69]
    1.8.3. Методика (модифицировано по [10]) [70]
  1.9. Анализ мини-препаратов ДНК с помощью рестрикциовного гидролиза и электрофореза в агарозном геле [71]
    1.9.1. Основные положения [71]
  1.10. Конъюгационный перенос рекомбинантиых плазмид в агробактерий [72]
    1.10.1. Основные положения [72]
    1.10.2. Обеспечение [74]
    1.10.3. Методика [75]
  1.11. Выделение тотальных препаратов нуклеиновых кислот из A. tumefaciens [76]
    1.11.1. Основные положения [76]
    1.11.2. Обеспечение [76]
    1.11.3. Методика (модифицирована по [17]) [77]
  1.12. Рестрикционный гидролиз тотальной ДНК агробактерий [78]
    1.12.1. Основные положения [78]
      Приложение 1 [I] [80]
        Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований [80]
      Приложение 1 [II] [82]
        А. Используемые в примерах бактериальные штаммы [82]
        Б. Антибиотики, используемые для селекции бактерий [82]
Литература [83]
Глава 2. Трансформация клеток двудольных растений с помощью Ti-плазмид Agrobacterium tumefaciens и Ri-плазмид A. rhizogenes. Дж. Дрейпер, Р. Скотт, Дж. Хэмил [87]
  2.1. Введение [87]
    2.1.1. Основные свойства агробактерий и векторов, которые используются для трансформации клеток растений [88]
    2.1.2. Поведение культивируемых растительных клеток, влияющее на их трансформацию агробактериями [92]
    2.1.3. Селекция трансформированных тканей и регенерация растений [95]
    2.1.4. Основные методы трансформации растительных клеток с помощью агробактериальных векторов [103]
  2.2. Трансформация с помощью онкогенных штаммов дикого типа A. tumfaciens и A. rhizogenes [105]
    2.2.1. Основные положения [105]
    2.2.2. Обеспечение [110]
    2.2.3. Методика [111]
  2.3. Трансформация больших гетерогенных эксплантатов с помощью неонкогенных Ti-плазмидных векторов [117]
  2.4. Прямая регенерация трансформированных растений: трансформация листовых дисков табака [119]
    2.4.1. Основные положения [119]
    2.4.2. Обеспечение [121]
    2.4.3. Методика [122]
  2.5. Регенерация трансформированных растений через стадию каллуса: трансформация эксплантатов проростков льна [130]
    2.5.1. Основные положения [130]
    2.5.2. Получение стерильных проростков льна и регенерация из эксплантатов проростков льна [132]
    2.5.3. Трансформация гипокотилей, регенерация из трансформированного каллуса, селекция, размножение и укоренение трансформированных побегов [135]
  2.6. Трансформация малых гомогенных эксплантатов [140]
    2.6.1. Основные положения [140]
    2.6.2. Разработка систем совместного культивирования [141]
  2.7. Выделение мезофильных протопластов табака [143]
    2.7.1. Основные положения [143]
    2.7.2. Обеспечение [145]
    2.7.3. Методика [146]
  2.8. Культивирование мезофильных протопластов табака [149]
    2.8.1. Основные положения [149]
    2.8.2. Обеспечение [150]
    2.8.3. Методика [150]
  2.9. Трансформация протопластов путем совместного культивирования с агробактериями [151]
    2.9.1. Основные положения [151]
    2.9.2. Обеспечение [152]
    2.9.3. Методика [153]
  2.10. Трансформация клеток суспензионной культуры моркови [160]
    2.10.1. Основные положения [160]
    2.10.2. Инициация проэмбриогеиных суспензионных клеточных культур моркови, приготовление фидерных чашек н высев на переносные диски [165]
    2.10.3. Инокуляция клеток моркови агробактериями, селекция трансформантов и регенерация путем соматического эмбриогенеза [167]
      Приложение 2 [I] [170]
        Обычные материалы для работы с культурой тканей [170]
      Приложение 2 [11] [171]
        Среда для культуры растительных клеток и тканей [171]
      Приложение 2 [111] [175]
        Антибиотики, добавляемые в среды для культур растительных клеток [175]
      Приложение 2 [IV] [176]
        Подготовка эксплантатов для инокуляции агробактериями [176]
      Приложение 2 [V] [178]
        Растворы для выделения протопластов табака [178]
      Приложение 2 [VI] [179]
        Выделение протопластов из измельченных кусочков листа [179]
      Приложение 2 [VII] [180]
        Методы флуоресцентного окрашивания для контроля развития растительных протопластов [180]
      Приложение 2 [VIII] [181]
        Примеры процедур генетической трансформации растений, основанных на системе переноса генов агробактерий [181]
Литература [181]
Глава 3. Трансформация растительных клеток путем трансфекции ДНК. Дж. Дрейпер, Р, Скотт, А. Кумар, Г. Дьюри [194]
  3.1. Введение [194]
    3.1.1. Ограничения системы трансформации с помощью агробактерий [194]
    3.1.2. Трансформация растительных протопластов изолированной векторной ДНК [196]
    3.1.3. Разработка стратегий трансформации протопластов путем трансфекции ДНК [197]
    3.1.4. Векторы для переноса генов посредством ДНК. (DMGT-векторы) [199]
    3.1.5. Трансформация интактных растительных тканей DMGT-векторами [201]
  3.2. Трансфекция протопластов с помощью полиэтиленгликоля [203]
    3.2.1. Основные положения [203]
    3.2.2. Стимулируемое ПЭГ поглощение ДНК протопластами [205]
    3.2.3. Выделение ДНК из протопластов и дот-блоттинг-гибридизация [206]
  3.3. Трансформация протопластов с помощью электропорации [212]
    3.3.1. Основные положения [212]
    3.3.2. Оптимизация методик электропорации с помощью временной экспрессии [216]
  3.4. Трансформация растительных клеток путем микроинъекций [221]
    3.4.1. Основные положения [221]
    3.4.2. Трансформация растений путем микроинъекций [223]
      Приложение 3 [I] [232]
        Выделение протопластов из клеток суспензионной альбинотической культуры Petunia hybrlda (сорт Blue Lace) [232]
Литература [232]
Глава 4. Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений. Дж. Дрейпер, Р. Скотт [236]
  4.1. Введение [236]
    4.1.1. Выделение ДНК [236]
    4.1.2. Выделение РНК [238]
  4.2. Выделение тотальной ДНК из лиофилизироваиных тканей растений [239]
    4.2.1. Общие положения [239]
    4.2.2. Выделение небольших количеств ДНК с помощью СТАВ-буфера [241]
    4.2.3. Выделение ДНК с помощью протеиназы [245]
  4.3. Выделение ДНК из свежего растительного материала [248]
    4.3.1. Общие положения [248]
    4.3.2. Выделение больших количеств тотальной ДНК из свежего растительного материала с помощью СТАВ-буфера [249]
    4.3.3. Выделение ДНК из свежих тканей с помощью ДСН [249]
    4.3.4. Выделение ДНК из свежих тканей с помощью ДСН и протеиназы К [252]
  4.4. Выделение ядерной ДНК [254]
    4.4.1. Выделение ядерной ДНК из свежих каллусов илв листьев [254]
    4.4.2. Выделение ядерной ДНК из протопластов [257]
  4.5. Выделение ДНК из хлоропластов и митохондрий [258]
    4.5.1. Общие положения [258]
    4.5.2. Обеспечение [259]
    4.5.3. Методика [260]
  4.6. Определение концентрации ДНК. в неочищенных препаратах нуклеиновых кислот с помощью дифениламина [262]
    4.6.1. Общие положения [262]
    4.6.2. Обеспечение [263]
    4.6.3. Методика [264]
  4.7. Выделение тотальной РНК из растений [265]
    4.7.1. Общие положения [265]
    4.7.2. Фенольный метод выделения тотальной РНК из растений [265]
    4.7.3. Метод выделения тотальной РНК из растений при помощи хлористого лития [269]
  4.8. Выделение роlу(А)+-мРНК [270]
    4.8.1. Общие положения [270]
    4.8.2. Обеспечение [271]
    4.8.3. Методика [272]
      Приложение 4 [I] [273]
        Выделение больших количеств тотальной ДНК из клеток растений с помощью СТАВ [273]
      Приложение 4 [II] [274]
        Очистка ДНК из растений в градиентах CsCl/БЭ [274]
Литература [276]
Глава 5. Анализ ДНК путем рестрикции и гибридизации по Саузериу. Р. Скотт [277]
  5.1. Введение [277]
  5.2. Обработка ДНК ферментами рестрикции [278]
    5.2.1. Общие положения [278]
    5.2.2. Обеспечение [279]
    5.2.3. Методика [279]
  5.3. Фракционирование ДНК методом электрофореза в агарозном геле [280]
    5.3.1. Общие положения [280]
    5.3.2. Обеспечение [281]
    5.3.3. Методика [282]
  5.4. Блоттинг по Саузериу обработанных рестриктазами и разделенных фрагментов ДНК [287]
    5.4.1. Общие положения [287]
    5.4.2. Обеспечение [288]
    5.4.3. Методика [289]
  5.5. Гибридизация ДНК, перенесенной на мембраны с помощью блоттинга по Саузериу [293]
    5.5.1. Общие положения [293]
    5.5.2. Обеспечение [293]
    5.5.3. Методика [295]
  5.6. Мечение препаратов для гибридизации с помощью олигонуклеотидной затравки [297]
    5.6.1. Общие положения [297]
    5.6.2. Обеспечение [298]
    5.6.3. Методика [299]
      Приложение 5 [I] [301]
        Буферы для рестриктаз [301]
      Приложение 5 [II] [302]
        Концевое мечение маркеров, полученных иа основе ДНК фага [302]
      Приложение 5 [III] [302]
        Определение включения метки в ДНК [302]
Литература [303]
Глава 6. Анализ организации и экспрессии генов растений. Р. Скотт, Дж. Дрейпер, Р. Джефферсон, Г. Дьюри, Л. Джэкоб [304]
  6.1. Введение [304]
    6.1.1. Принцип организации генов растений [304]
    6.1.2. Строение мРНК [306]
    6.1.3. Перенос продуктов генов в клетке [306]
    6.1.4. Использование генетической трансформации для изучения экспрессии генов растений [307]
    6.1.5. Использование траисгенных растений для изучения последовательностей, регулирующих транскрипцию [308]
    6.1.6. Изучение регуляторных последовательностей с помощью индикаторных генов [308]
  6.2. Изучение организации Т-ДНК методом блоттинг-гибридизации по Саузериу [311]
    6.2.1. Общие положения [311]
    6.2.2. Организация последовательностей чужеродной ДНК в тканях растений [313]
    6.2.3. Изучение организации Т-ДНК в трансгенных растениях моркови методом блоттинг-гибридизации [317]
  6.3. Анализ экспрессии генов методом точечного нозери-блоттинга [324]
    6.3.1. Регуляция транскрипции гена Cab в этиолированном растении гороха под действием фитохрома [326]
  6.4. Использование CAT в качестве индикаторного гена дли изучения контроля экспрессии генов в различных органах и при изменении условий среды [331]
    6.4.1. Общие положения [331]
    6.4.2. Определение активности хлорамфениколацетилтрансфе-разы (CAT) [333]
    6.4.3. Примеры использования cat в качестве индикаторного гена для изучения контроля экспрессии гена Cab-cat в различных органах и в зависимости от условий среды [336]
  6.5. Применение неомицинфосфотрансферазы-II (NPT-II) в качестве индикаторного белка для изучения роли последовательностей, участвующих в переносе белков (транзитных пептидов) [340]
    6.5.1. Общие положения [340]
  6.6. Выделение интактных хлоропластов табака [343]
    6.6.1. Общие положения [343]
    6.6.2. Обеспечение [344]
    6.6.3. Методика [345]
  6.7. Определение активности NPT-II in situ [346]
    6.7.1. Общие положения [346]
    6.7.2. Неденатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле [347]
    6.7.3. Определение NPT-II in situ после электрофореза [352]
  6.8. Определение NPT-II методом вестери-блоттинга [357]
    6.8.1. Общие положения [357]
  6.9. Получение химерных генов с последовательностями, кодирующими индикаторный фермент: система слияния с геном GUS [362]
    6.9.1. Общие положения [363]
    6.9.2. Слияние с геном GUS [364]
    6.9.3. Определение активности GUS в экстрактах растений [366]
    6.9.4. Выделение GUS из тканей растений [366]
    6.9.5. Флуориметрическое определение активности GUS [368]
    6.9.6. Выявление GUS in situ с использованием денатурирующего полиакриламидного геля [371]
    6.9.7. Гистохимическое выявление GUS на срезах тканей растений [374]
  6.10. Определение нопалина в трансформированных растительных тканях [377]
    6.10.1. Общие положения [377]
    6.10.2. Обеспечение [378]
    6.10.3. Методика [379]
      Приложение 6 [I] [383]
        Нозерн-блоттинг [383]
      Приложение 6 [II] [385]
        Выделение NPT-II и CAT из бактерий [385]
      Приложение 6 [III] [386]
        Определение концентрации белка по Бредфорду [386]
      Приложение 6 [IV] [386]
        Определение агропина и маниопина [386]
Литература [387]
Список фирм, поставщиков реактивов и оборудования [391]
Предметный указатель [395]
Указатель латинских названий [398]
Указатель методик [400]

Раздел
«Генная инженерия»

Генная
инженерия растений

Возможности
генной инженерии

Первые
трансгенные растения (растения табака
со встроенными генами из микроорганизмов)
были получены в 1983 г. Первые успешные
полевые испытания трансгенных растений
(устойчивые к вирусной инфекции растения
табака) были проведены в США уже в 1986 г.

После
прохождения всех необходимых тестов
на токсичность, аллергенность, мутагенность
и т.д. первые трансгенные продукты
появились в продаже в США в 1994 г. Это
были томаты Flavr Savr с замедленным
созреванием, созданные фирмой «Calgen»,
а также гербицид-устойчивая соя компании
«Monsanto». Уже через 1-2 года
биотехнологические фирмы поставили на
рынок целый ряд генетически измененных
растений: томатов, кукурузы, картофеля,
табака, сои, рапса, кабачков, редиса,
хлопчатника.

В
настоящее время получением и испытанием
генетически модифицированных растений
занимаются сотни коммерческих фирм во
всем мире с совокупным капиталом более
ста миллиардов долларов. В 1999 г. трансгенные
растения были высажены на общей площади
порядка 40 млн. га, что превышает размеры
такой страны, как Великобритания. В США
генетически модифицированные растения
(GM Crops) составляют сейчас около 50% посевов
кукурузы и сои и более 30-40% посевов
хлопчатника. Это говорит о том, что
генно-инженерная биотехнология растений
уже стала важной отраслью производства
продовольствия и других полезных
продуктов, привлекающей значительные
людские ресурсы и финансовые потоки. В
ближайшие годы ожидается дальнейшее
быстрое увеличение площадей, занятых
трансгенными формами культурных
растений.

Первая
волна трансгенных растений, допущенных
для практического применения, содержала
дополнительные гены устойчивости (к
болезням, гербицидам, вредителям, порче
при хранении, стрессам).

Нынешний
этап развития генетической инженерии
растений получил название «метаболическая
инженерия». При этом ставится задача
не столько улучшить те или иные имеющиеся
качества растения, как при традиционной
селекции, сколько научить растение
производить совершенно новые соединения,
используемые в медицине, химическом
производстве и других областях. Этими
соединениями могут быть, например,
особые жирные кислоты, полезные белки
с высоким содержанием незаменимых
аминокислот, модифицированные
полисахариды, съедобные вакцины,
антитела, интерфероны и другие
«лекарственные» белки, новые
полимеры, не засоряющие окружающую
среду и многое, многое другое. Использование
трансгенных растений позволяет наладить
масштабное и дешевое производство таких
веществ и тем самым сделать их более
доступными для широкого потребления.

Улучшение качества запасных белков

Запасные
белки основных культурных видов
кодируются семейством близкородственных
генов. Накопление запасных белков семян
– сложный биосинтетический процесс.
Первая генноинженерная попытка улучшения
свойства одного растения путем введения
гена запасного белка от другого была,
проведена Д. Кемпом и Т. Холлом в 1983 г. в
США. Ген фазеолина бобов с помощью
Ti-плазмиды был перенесен в геном
подсолнечника. Результатом этого опыта
было лишь химерное растение, получившее
название санбин. В клетках подсолнечника
были обнаружены иммунологически
родственные фазеолиновые полипептиды,
что подтверждало факт переноса гена
между растениями, относящимися к
различным семействам

Позднее
ген фазеолина был передан клеткам
табака: в растениях-регенерантах ген
экспрессировался во всех тканях, хотя
и в малых количествах. Неспецифическая
экспрессия фазеолинового гена, так же
как и в случае переноса его в клетки
подсолнечника, сильно отличается от
экспрессии этого гена в зрелых семядолях
бобов где фазеолин составлял 25—50% от
общего белка. Этот факт указывает на
необходимость сохранения и других
регуляторных сигналов этого гена при
конструировании химерных растений и
на важность контроля экспрессии генов
в процессе онтогенеза растений.

Ген,
кодирующий запасной белок кукурузы –
зеин, после интеграции его в Т-ДНК был
перенесен в геном подсолнечника следующим
образом. Штаммы агробактерий, содержащие
Ti-плазмиды с геном зеина, использовали
для индукции опухолей в стеблях
подсолнечника. Некоторые из полученных
опухолей содержали мРНК, синтезируемые
с генов кукурузы, что дает основание
рассматривать эти результаты как первое
доказательство транскрипции гена
однодольного растения в двудольном.
Однако присутствие зеинового белка в
тканях подсолнечника не обнаружилось.

Более
реальной задачей для генетической
инженерии считается улучшение
аминокислотного состава белков. Как
известно, в запасном белке большинства
злаковых наблюдается дефицит лизина,
треонина, триптофана, у бобовых —
метионина и цистеина. Введение в эти
белки дополнительных количеств дефицитных
аминокислот могло бы ликвидировать
аминокислотный дисбаланс. Методами
традиционной селекции удалось существенно
повысить содержание лизина в запасных
белках злаковых. Во всех этих случаях
часть проламинов (спирторастворимые
запасные белки злаковых) заменялась
другими белками, содержащими много
лизина. Однако у таких растении уменьшались
размеры зерна и снижалась урожайность.
По-видимому, проламины необходимы для
формирования нормального зерна, и их
замена другими белками отрицательно
влияет на урожайность. Учитывая это
обстоятельство, для улучшения качества
запасного белка зерновых нужен такой
белок, который не только отличался бы
высоким содержанием лизина и треонина,
но и мог полноценно заменить определенную
часть проламинов при формировании
зерна.

Растения
могут производить и белки животного
происхождения. Так, встраивание в геном
растений Arabidopsis thaliana и Brassica napus химерного
гена, состоящего из части гена запасного
25-белка арабидопсиса и кодирующей части
для нейропептида — энкефалина, приводило
к синтезу химерного белка до 200 нг на 1
г семени. Два структурных белковых
домена были связаны последовательностью,
узнаваемой трипсином, что давало
возможность в дальнейшем легко изолировать
чистый энкефалин.

В
другом эксперименте удалось после
скрещивания трансгенных растений, в
одном из которых был встроен ген
гамма-субъединицы, а во втором — ген
каппа-субъединицы иммуноглобулина,
получить у потомства экспрессию обеих
цепей. В результате растение формировало
антитела, составляющие до 1,3% суммарного
белка листьев. Также было показано, что
в растениях табака могут собираться
полностью функциональные секреторные
моноклональные иммуноглобулины.
Секреторные иммуноглобулины обычно
выделяются в ротовую полость и желудок
человека и животных и служат первым
барьером на пути кишечных инфекций. В
упомянутой выше работе получили продукцию
в растениях моноклональных антител,
которые были специфичны для Streptococcus
mutans — бактерий, вызывающих зубной кариес.
Предполагается, что на основе таких
моноклональных антител, продуцируемых
трансгенными растениями, удастся создать
действительно антикариесную зубную
пасту. Из других белков животного
происхождения, которые представляют
интерес для медицины, показана продукция
в растениях человеческого β-интерферона.

Разработаны
также подходы, позволяющие получать
бактериальные антигены в растениях и
использовать их в качестве вакцин.
Получен картофель, экспрессирующий
олигомеры нетоксичной субъединицы
β-токсина холеры. Эти трансгенные
растения могут быть использованы для
получения дешевой вакцины от холеры.

Жиры

Важнейшим
сырьем для получения разного рода
химических веществ являются жирные
кислоты — основной компонент растительного
масла. По своей структуре это углеродные
цепи, которые обладают различными
физико-химическими свойствами в
зависимости от своей длины и степени
насыщения углеродных связей. В 1995 году
была закончена экспериментальная
проверка и получено разрешение от
федеральных властей США на выращивание
и коммерческое использование трансгенных
растений рапса с измененным составом
растительного масла, включающего вместе
с обычными 16- и 18-членными жирными
кислотами также и до 45% 12-членной жирной
кислоты — лаурата. Это вещество широко
используется для производства стиральных
порошков, шампуней, косметики.

Экспериментальная
работа заключалась в том, что был
клонирован ген специфической тиоэстеразы
из растения Umbellularia califomica, где содержание
лаурата в жире семян достигало 70%.
Структурная часть гена этого фермента
под контролем промотора-терминатора
гена белка, специфического для ранней
стадии семяобразования, была встроена
в геном рапса и арабидопсиса, что и
привело к увеличению содержания лаурата
в масле этих растений.

Из
других проектов, связанных с изменением
состава жирных кислот, можно упомянуть
работы, ставящие целью повышение или
снижение содержания ненасыщенных жирных
кислот в растительном масле. Интересными
представляются эксперименты с
петрозелиновой кислотой — изомером
олеиновой кислоты, где двойная связь
находится за шестым углеродным членом.
Эта жирная кислота входит в состав масла
кориандра и определяет его более высокую
температуру плавления (33°С), в то время
как при наличии олеиновой кислоты
температура плавления составляет только
12°С. Предполагается, что после переноса
генов, определяющих синтез петрозелиновой
кислоты, в растения — продуценты
растительного масла удастся производить
диетический маргарин, содержащий
ненасыщенную жирную кислоту. Кроме
того, из петрозелиновой кислоты очень
легко получать лаурат путем окисления
озоном. Дальнейшее изучение специфики
биохимического синтеза жирных кислот,
по-видимому, приведет к возможности
управлять этим синтезом с целью получения
жирных кислот различной длины и различной
степени насыщения, что позволит
значительно изменить производство
детергентов, косметики, кондитерских
изделий, затвердителей, смазочных
материалов, лекарств, полимеров,
дизельного топлива и многого другого,
что связано с использованием углеводородного
сырья.

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]

• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #

ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ РАСТЕНИЙ

5.1 Проблемы биобезопасности

5.2. Получение трансгенных растений

5.3. Применение методов генетической инженерии для улучшения аминокислотного состава запасных белков растений

5.4. Повышение эффективности процесса фотосинтеза

5.5. Генно-инженерные подходы к решению проблемы усвоения азота

5.6. Изменение качества плодов

5.7. Устойчивость растений к гербицидам

5.8. Устойчивость растений к фитопатогенам и насекомым

5.9. Устойчивость растений к абиотическим стрессам

Генно-инженерные методы, в частности технология рекомби­нантных ДНК, позволяют создавать новые генотипы и, следовательно, новые формы растений гораздо быстрее, чем классические методы селекции. Кроме того, появляется возможность целена­правленного изменения генотипа — трансформации — благода­ря введению определенных генов.

Считается, что трансгенные растения более безопасны, чем сорта, полученные методами традиционной селекции, но с при­менением мутагенеза (В. Ф. Федоренко и др., 2005). Есть мнение, что риск использования трансгенных растений в мирных биотех­нологиях намного ниже, чем в случае применения других транс­генных организмов (Я. И. Бурьянов, 1999). Генетическая инжене­рия растений развивается очень быстрыми темпами. Она позво­ляет решать проблемы фундаментальной науки, а также много­численные практические задачи. Намечается тенденция разделе­ния прикладных генно-инженерных исследований на три направ­ления:

1. Решение проблем сельскохозяйственного комплекса, таких, как повышение продуктивности сельскохозяйственных растений, их защита от различных биотических и абиотических факторов. Это особенно важно в связи с быстрым ростом населения Земли. Считается, что генетически модифицированные (ГМ) растения помогут решить проблему увеличения производства продуктов питания, поэтому сейчас наблюдается весьма значительное рас­ширение сельскохозяйственных угодий, занятых посевами ГМ — растений. Если в 1996 г. эти посевы занимали 1,7 млн га, то в 2001 г. — 52,6 млн га, а в 2003 г. — почти 70 млн га.
2. Создание трансгенных растений — продуцентов новых ве­ществ для использования в области медицины и технической про­мышленности, приспособленных для роста в полевых условиях. Так, на основе трансгенных растений возможно получение «съе­добных» вакцин, антител (например, иммуноглобулиновых ком­плексов).

Развитие и совершенствование культуры трансгенных клеток и тканей растений, синтезирующих ценные биологически активные соединения. Довольно часто продуцентами важных пищевых, лекарственных или технически важных веществ служат уникальные тропические и эндемические растения, не доступные для выращи­вания в других климатических зонах или занесенные в «Красную книгу». Перенос генов, отвечающих за синтез специфических со­единений, из редких растений в более доступные превращает пос­ледние в биологические фабрики необходимых веществ.

Генетическая трансформация может принести большую пользу для сельского хозяйства, медицины, промышленности, фундамен­тальной науки.

Однако биотехнология и, в частности, генетическая инжене­рия подошли к той ступени развития, когда приходится прежде всего думать о возможных последствиях эксперимента, об исполь­зовании полученных знаний. «Генетическая инженерия — это мощный способ изменить жизнь, но ее потенциал может пред­ставлять собой опасность» (Р. Доукинс, цит.: Современная биотех­нология. Мифы и реальность, 2004). В связи с этим первостепен­ными становятся вопросы биологической безопасности.

Под биологической безопасностью понимается защищен­ность человека, общества, цивилизации и окружающей среды от вредного воздействия, опасного для жизни и здоровья лю­дей, от токсичных и аллергенных биологических веществ и со­единений, содержащихся в природных или генетически моди­фицированных биологических объектах и полученных из них продуктах (О. С. Машкина, А. К. Буторина, 2005). В настоящее время выделяют три группы риска, возникающие при возделы­вании и потреблении генетически модифицированных организ­мов (ГМО): пищевые, экологические, агротехнические. Причи­ны возникновения этих рисков состоят в непредсказуемости встраивания дополнительной ДНК в геном организма, возмож­ности плейотропного эффекта встроенного гена, нарушении стабильности генома трансгенных растений, присутствии во встраиваемой конструкции «лишних» векторных генов, аллерги­ческих и токсических эффектах чужеродного белка, возможно­сти горизонтального переноса трансгенных конструкций в геном симбионтных для человека и животных бактерий (В. В. Кузнецов и др., 2004). По-видимому, есть закономерность между увеличе­нием числа аллергических заболеваний и потреблением ГМ-про- дуктов в странах, где это потребление разрешено. Так, в США и Скандинавии был проведен сравнительный анализ количества пищевых заболеваний. Эти страны были выбраны в связи с тем, что единственным существенным различием в качестве питания были потребление генетически модифицированных продуктов в США и их отсутствие в рационе народов Скандинавии. Оказа­лось, что в США частота пищевых заболеваний в 3 — 5 раз выше

чем в странах Скандинавии (В. В. Кузнецов и др., 2004). Нельзя исключить, что генетическая инженерия может привести к ре­зультатам, опасным для человека и природы. Поэтому несомнен­но, что биологическая безопасность должна стать одной из при­оритетных задач человечества в целом и каждой цивилизован­ной страны в отдельности (А.С.Спирин, 1997, цит.: В.В.Кузне­цов и др., 2004).

5.2. Получение трансгенных растений

Технологии получения трансгенных растений практически совпадают с теми технологиями, которые обсуждались в учебном пособии, когда речь шла о передаче генетической информации у микроорганизмов и животных. Поэтому в данном разделе рас­смотрим только те системы, которые специфичны для раститель­ных организмов.

Векторы на основе Ti-плазмид. Перенос генов и их встраи­вание в геном двудольных растений (трансформация) осуществ­ляются главным образом благодаря конструированию векторов, характерных для растений. Эти векторы создаются на основе Ti-плазмид, находящихся в клетках бактерий Agrobacterium faciens.

Среди многочисленных почвенных бактерий существуют бак­терии рода Agrobacteria, которые могут передавать часть своих генов в геном растительной клетки, вызывая коренные измене­ния в ее свойствах. Так, бактерия A. tumefaciens вызывает обра­зование опухолей — корончатых галлов. Способность этой бак­терии к образованию опухоли связана с геномом большой внехромосомной плазмиды —Ti-плазмиды (от англ. tumor inducing — ин­дуцирующие опухоль). Другие бактерии ( . rhizogenes) вызывают усиленное образование корней при заражении растений. За этот процесс ответственны содержащиеся в бактериальных клетках Ri- плазмиды (от англ. root inducing — индуцирующий корни). Ti- и Ri-плазмиды — естественные векторы для дополнительных генов, обладающие свойствами, которые необходимы для трансформа­ции растительных клеток. Они имеют широкий круг хозяев, а в бактериальных клетках реплицируются автономно. Ri-плазмиды выгодно отличаются от Ti-плазмид тем, что они не онкогенны. Клетки растений, трансформированные с помощью Ri-плазмид, сохраняют способность к морфогенезу и регенерации растений. В связи с этим Ri-плазмиды в данный момент рассматриваются как более перспективные для создания векторов. Однако Ti-плаз­миды изучены лучше, поэтому их, как правило, используют при работе с растениями.

Доказательством того, что именно Ti-плазмиды отвечают за трансформацию растительных клеток в опухолевые, служит тот факт, что клетки агробактерий, лишенные Ti-плазмид, не могут вызвать в инфицированном растении ни образования коронча­тых галлов, ни синтеза опинов. Опины — это уникальные продук­ты конденсации амино- и кетокислот или аминокислот и сахаров, которые используются бактериями в качестве источников азота, углерода и энергии.

После заражения часть Ti-плазмиды встречается в хромосомах клеток растения-хозяина. Следовательно, A. tumefaciens встраи­вает часть своего генома в ДНК растительной клетки и заставля­ет ее таким способом изменять метаболизм, синтезируя вещества, необходимые для бактерий. Сама бактерия в растительную клет­ку не проникает. Она остается в межклеточном пространстве, используя трансформированные клетки растений в качестве био­логической «фабрики» по производству опинов.

Участок Ti-плазмиды, который встраивается в геном расти­тельных клеток, называется Т-ДНК — трансформирующая ДНК (transferred DNA). Величина Т-ДНК составляет примерно 10% от размера всей Ti-плазмиды, т.е. 12—22 тыс. п.н. Т-ДНК содержит гены, отвечающие за индукцию образования опухоли, синтез опи­нов и фитогормонов (ауксинов и цитокининов), подавляющих дифференцировку клеток растения-хозяина. Гены, отвечающие за вырезание Т-ДНК и ее перенос в растительную клетку, располо­жены в области вирулентности (vir-область) той же самой плаз­миды. Кроме того, в состав Ti-плазмиды входят гены tra-области, контролирующие конъюгацию бактерий, и гены ori-области, продукты которых обеспечивают репликацию Ti-плазмиды (рис. 5.17).

Молекулярно-генетический механизм естественной трансфор­мации растительных клеток с помощью Ti-плазмид изучен дос­таточно хорошо. В этом процессе можно выделить несколько этапов:

• восприятие раневых си гнал ор растительной клетки хеморе­цепторами бактерии и прикрепление агробактерии к стенке клет­ки растения;
• вырезание Т-ДНК из Ti-плазмиды;
• проникновение Т-ДНК внутрь клетки растения;
• интеграция Т-ДНК в геном растения и ее экспрессия.

Трансформация начинается только там, где есть поврежденные клетки. Весь процесс «узнавания» нужной растительной клетки, вырезания, транспорта и встраивания Т-ДНК в растительный геном осуществляют белки — продукты генов, локализованных в vir-области Ti-плазмиды. Продукты гидролиза поврежденной кле­точной стенки (ацетосирингон и гидроксиацетосирингон) воспринимают хеморецепторы, встроенные в плазматическую мем­брану агробактерии.

Среди них одна из главных ролей принадле­жит продукту деятельности генов vir-области — гистидиновой протеинкиназе, которая активирует транскрипцию остальных vir- генов. Индукция этих генов обратима, что очень важно для бак­терий. Если растительный организм ослаблен или вообще нежиз­неспособен, процесс останавливается и Т-ДНК не переносится в такую клетку. Другой продукт генов vir-области — эндонуклеаза, которая отвечает за вырезание Т-ДНК. Белки virB и virE транс­портируют Т-ДНК в одноцепочечной форме из бактерии в цито­плазму растительной клетки. Механизм переноса Т-ДНК, по-ви­димому, аналогичен переносу плазмидной ДНК в процессе конъ­югации. Встраивание Т-ДНК в геном клетки растения становит­ся возможным благодаря наличию гомологичных участков между растительной и плазмидной ДНК в местах встраивания. После внедрения Т-ДНК становится обычной частью генома растения и наследуется как доминантный признак в соответствии с зако­нами Менделя (рис. 5.18).

Именно способность участка Ti-плазмиды A. tumefaciens встраиваться и экспрессироваться в геноме растительной клетки послужила поводом для попытки создания на основе этой плаз­миды вектора, доставляющего дополнительные гены в клетку. Т-ДНК ограничена с двух сторон повторяющимися последова­тельностями (фланкирующими последовательностями), по кото­рым и происходит вырезание этого участка ДНК из плазмиды. Ка­залось бы, что любая ДНК, встроенная между этими последова­тельностями, будет принята за Т-ДНК и перенесена в раститель­ную клетку любых двудольных растений.

Однако,Ti-плазмида как вектор обладает некоторыми недо­статками: большие размеры Ti-плазмиды (от 200 до 800 тыс. п. н.); отсутствие способности реплицироваться в клетках Е. coli, что необходимо для клонирования рекомбинантных плазмид; неспо­собность трансформированных с помощью Ti-плазмид клеток к регенерации целого растения; неспособность к трансформации клеток почти всех однодольных растений. Основной недостаток — слишком большие размеры Ti-плазмиды, которые делают весьма затруднительными манипуляции с ней во время конструирования вектора. Для решения этой проблемы разработана технология создания промежуточного вектора с применением классического объекта генетической инженерии – Е.coli.

Процесс начинается с создания рекоминантной структутры, которую можно достаточно просто клонировать, т.е. многократно увеличивать число ее копий. Т-ДНК вырезают в помощью рестриктаз из Ti-плазмиды и встраивают в небольшую плазмиду pBR322, способную реплицироваться в клетках E.coli. В этих клетках рекомбинантную ДНК клонируют, после чего встраива­ют в Т-ДНК дополнительные гены и повторяют клонирование. Полученные многочисленные копии промежуточной векторной ДНК вводят в клетки A. tumefaciens, содержащие обычные Ti- плазмиды. В результате гомологичной рекомбинации Т-ДНК с встроенными в нее дополнительными генами замещает нормаль­ную Т-ДНК в Ti-плазмидах. После этого отбирают с помощью генов-маркеров трансформированные агробактерии и заражают ими растительные клетки. Дополнительные гены вместе с Т-ДНК встраиваются в геном растения, и в конце концов образуется ге­нетически модифицированный организм с заданными свойства­ми (рис. 5.19). Эту довольно сложную технологию можно упрос­тить, если использовать бинарные векторы.

Бинарные векторы представляют собой бактерии, содержащие две разные Ti-плазмиды. Одна из них несет vir-область и обеспе­чивает интеграцию в геном растительной клетки Т-области, со­держащей любые гены другой плазмиды. В этом случае двойной кроссинговер не требуется.

Векторы на основе ДНК-содержащих вирусов растений. Вирусы можно рассматривать как разновидности чужеродной нуклеиновой кислоты, которые реплицируются и экспрессиру­ются в клетках растений. Подавляющее большинство фитовиру­сов в качестве носителя генетической информации содержат РНК. Только 1 — 2% вирусов, инфицирующих растения, отно­сятся к ДНК-содержащим. Именно эти вирусы удобны для ис­пользования в технологии рекомбинантных ДНК, а также в ка­честве векторов.

ДНК-содержащие вирусы могут включать одноцепочечную или двухцепочечную ДНК. В качестве представителей первой группы можно назвать вирус золотистой мозаики фасоли (ВЗМФ) или вирус полосатости кукурузы. Наиболее изученный предста­витель группы вирусов с двухцепочечной ДНК — вирус мозаики цветной капусты (ВМЦК), поражающий в основном растения се­мейства крестоцветные.

Обычно фитовирусы реплицируются с образованием большо­го числа копий молекул нуклеиновых кислот — 10 и более моле­кул на зараженную клетку. Поэтому фитовирусы представляют со­бой очень эффективные средства для получения хорошей эксп­рессии чужеродного гена. Кроме высокой копийности вирусной нуклеиновой кислоты вирусные векторные системы имеют еще ряд преимуществ: малый размер генома (возможность легкой ма­ни пуляции вирусной ДНК) и сильные промоторы, обеспечиваю­щие эффективную экспрессию чужеродных генов.

Однако вирусы в качестве векторов обладают и существенны­ми недостатками: имеют небольшую емкость, патогенны и не­способны встраиваться в хромосомы хозяина. Небольшую емкость можно увеличить, если инфицировать вирусом (например, ВМЦК) растительные протопласты, а не клетки. В этом случае инфекция не передается от клетки к клетке, нет необходимости в упаковке ДНК в вирусные частицы. Следовательно, часть вирус­ного генома, ответственная за упаковку в вирусные частицы, мо­жет быть удалена и замещена дополнительной чужеродной ДНК. Другой недостаток — отсутствие способности встраиваться в ге­ном растительной клетки — удается обойти (по крайней мере для ВМЦК) благодаря специальному методическому приему — агроинфекции. Для этого геном ВМЦК встраивают в Т-область Ti- плазмиды и в ее составе интегрируют в ядерный геном различных растений.

Методы прямого переноса генов в растение. Эти методы стали использоваться для растений благодаря появлению специ­фического объекта — изолированных протопластов, т. е. клеток, лишенных целлюлозной стенки.

Методы прямого переноса генов довольно многочисленны:

Трансформация растительных протопластов. Метод осуще­ствляется благодаря комбинации методик кальциевой преципи­тации ДНК и слияния протопластов. Для трансформации может быть использован практически любой ДНК-вектор. Донорная ДНК может не содержать специальных биологических сигналов (vir-областей, пограничных областей Т-ДНК).

Заражение культуры протопластов на начальной стадии ее роста агробактериями, которые используют в качестве векторов.

Микроинъекции ДНК. Этот метод аналогичен методу мик­роинъекций животных клеток. Его можно рассматривать как наи­более универсальный. Эффективность трансформации раститель­ных клеток — 10 — 20 % независимо от типа вектора. Трансфор­мация не видоспецифична, возможен перенос генов в любое ра­стение.

Электропорация. Метод основан на повышении проницае­мости биомембран за счет действия импульсов высокого напря­жения. В результате молекулы ДНК проникают в клетки через поры в клеточной мембране.

Упаковка в липосомы. Это один из методов, позволяющих защитить экзогенный генетический материал от разрушения нуклеазами растительной клетки. Липосомы — сферические тельца, оболочки которых образованы фосфолипидами.

Метод биологической баллистики. Это один из самых эффек­тивных методов трансформации однодольных растений. Исходный материал для трансформации — суспензионная культура, каллусная ткань или 4 — 5-дневные культивируемые незрелые зародыши однодольных.

Метод основан на напылении ДНК-вектора на мельчайшие ча­стички вольфрама, которыми затем бомбардируют клетки. Бом­бардировка осуществляется с помощью биолистической пушки за счет перепада давления. Часть клеток гибнет, а выжившие клет­ки трансформируются, затем их культивируют и используют для регенерации растений.

5.3 Применение методов генетической инженерии для улучшения аминокислотного состава запасных белков растений

Решение проблемы создания новых форм растений подра­зумевает в первую очередь повышение качества синтезируемых растением продуктов, которые определяют его питательную и техническую ценность. В основном это касается запасных бел­ков.

В большинстве случаев запасные белки растений имеют несба­лансированный для питания человека и животных аминокислот­ный состав. Так, запасные белки злаков — проламины — бедны лизином, триптофаном и треонином, что снижает их питательную и кормовую ценность. Улучшение аминокислотного состава бел­ка путем традиционной селекции не дает желательных результа­тов, поскольку необходимые гены часто сцеплены с нежелатель­ными признаками и наследуются вместе. Например, у мутантов кукурузы и ячменя повышение содержания лизина коррелирова­ло с уменьшением синтеза основных запасных белков — зеина и гордеина, а также с уменьшением урожайности.

Операции по получению трансгенных растений с улучшенным аминокислотным составом белка разделены на ряд этапов:

1) кло­нирование генов запасных белков;

2) изучение механизмов тка­неспецифичной и временной экспрессии белков и выявление пос­ледовательностей ДНК, определяющих данный механизм;

3) це­ленаправленное изменение последовательностей генов запасных белков для улучшения аминокислотного состава;

4) создание век­торов, содержащих измененный ген;

5) введение модифицирован­ных генов в растения.

В настоящее время клонированы 10 генов гордеинов ячменя, гены а- и б-глиадинов и глютенина пшеницы, зеинов кукурузы, легумина бобовых, пататина картофеля и ряд других. Имеются практические результаты трансформации растений. Так, введение в геном пшеницы модифицированного гена проламина привело к активному синтезу модифицированного белка, а также повли­яло на состав и уровень соответствующих запасных белков. В ито­ге улучшилось хлебопекарное качество пшеничной муки.

5.4. Повышение эффективности процесса фотосинтеза

Один из возможных способов увеличения фотосинтеза и, следовательно, продуктивности растений состоит в клонирова­нии хлоропластных генов в клетках бактерий и их переносе в ра­стения. Известно, что хлоропласты и прокариотические клетки сходны по ряду признаков. На основании этого возникла сим­биотическая гипотеза происхождения хлоропластов, впервые выдвинутая А. С. Фаминциным (1886). Согласно этой гипотезе, клетки прокариот и хлоропласты сходны. В них присутствуют кольцевые ДНК, 708-рибосомы; синтез белков начинается с од­ной и той же аминокислоты — N-формилметионина, а синтез белка подавляется хлорамфениколом, а не циклогексимидом, как у эукариот. Позже было показано, что ДНК-зависимая РНК- полимераза Е. coli связывается с определенными участками ДНК хлоропластов шпината.

В клетках Е. coli инициация белкового синтеза частично ре­гулируется доступностью участка связывания рибосом (УСР). Его структура до конца еще не выяснена, но расшифрован участок, известный под названием «последовательность Шайн—Дальгарно» (ШД). Она комплементарна б-концу 168-рибосомальной РНК, и инициация белкового синтеза начинается с образования комплементарной пары между этой последовательностью и 3′-кон­цом 168-рибосомальной РНК. Анализ последовательности ДНК хлоропластного гена большой субъединицы основного фермента фотосинтеза — рибулозобисфосфаткарбоксилазы — оксигеназы (Рубиско) кукурузы — выявил значительные гомологии с извест­ными промоторами и последовательностями ШД клеток Е. coli. Все это привело к попытке клонирования генов хлоропластов в клетках Е. coli, наиболее часто используемой в генно-инженерных исследованиях.

Транскрипционные конструкции могут создаваться двумя пу­тями: во-первых, это установка промотора рядом с УСР, который узнается полимеразой Е. coli, во-вторых, это формирование гибридного УСР, состоящего из прокариотической последовательно­сти ШД и эукариотического или синтетического инициирующе­го кодона. Первый путь широко применяется для увеличения экспрессии генов Е. coli и хлоропластных генов в клетках Е. coli.

В настоящее время уже клонировано несколько хлоропластных генов: гены синтеза субъединиц Рубиско, белка хлорофилл-белкового комплекса, АТФсинтетазы, цитохрома и др.

5.5. Генно-инженерные подходы к решению проблемы усвоения азота

Азот — один из самых необходимых элементов для растений. Его недостаток в почве или питательном субстрате часто приводит рас­тение к гибели, поэтому в первую очередь необходимо внесение в почву азотных удобрений. Однако их производство требует очень больших энергетических затрат, поэтому оно дорогостояще. Сто­имость азотных удобрений в 6 раз выше стоимости фосфорных удоб­рений и в 16 раз выше стоимости калийных удобрений. При этом растения используют только от 30 до 70 % внесенных в почву дос­тупных форм азота, остальное просто вымывается из почвы, за­грязняя окружающую среду. Гораздо более естественно и доступно снабжение растений азотом путем его биологической фиксации.

Фиксация атмосферного азота (диазотрофность) — свойство прокариотических организмов. Азотфиксирующие организмы де­лятся на симбиотические (90 %) и свободноживущие (10 %). Фиксация атмосферного азота связана преимущественно с симбиоти­ческими микроорганизмами. В настоящее время известны четы­ре основные системы симбиоза, имеющие большое значение не только для естественных сообществ, но и для сельского хозяйства, лесоводства. Это Rhizobia — бобовые растения, Azolla-Anabaena — рис, Actinomyces — деревья, Spirillum — травы. Атмосфер­ный азот фиксируется благодаря уникальному ферменту — нитрогеназе.

В 1960 г. американские исследователи показали, что нитрогеназа сохраняет свою активность в бесклеточных экстрактах Clostridium pasteurianum. Это послужило толчком для начала ак­тивных исследований биохимии азотфиксации, структуры и ме­ханизма действия нитрогеназы. К 1981 г. нитрогеназа была выде­лена из 36 видов микроорганизмов. Она считается одним из наи­более сложных ферментов, использующих простые субстраты. Кроме азота нитрогеназа может восстанавливать ацетилен, циа­нистый водород, закись азота и некоторые другие соединения. Восстановление ацетилена в этилен позволило разработать надеж­ный тест для обнаружения азотфиксирующей активности. Непре­менное условие работы нитрогеназы — ее защита от кислорода, который ингибирует не только активность нитрогеназы, но и ее биосинтез.

Начиная с 1970 г. стали появляться серьезные работы по изу­чению генов азотфиксации и их переносу в клетки Klebsiella pneumoniae и Е. coli. С помощью техники рекомбинантных ДНК были составлены генетические карты генов азотфиксации (nif-ге­нов), которые показали сходную организацию генов у большей части азотфиксирующих организмов. Было установлено, что nif- гены расположены между генами, кодирующими биосинтез гис­тидина (his) и генами, ответственными за усвоение шикимовой кислоты (shiA). Гены, кодирующие синтез белковых субъединиц компонентов нитрогеназы, образуют единый оперон (рис. 5.20). В клетках симбиотических бактерий Rhizobium leguminosarum, R. meliloti, R. trifolii плазмиды, кроме структурных генов нитроге­назы, содержат гены, отвечающие за развитие корневых клубеньков у определенных видов бобовых.

Конструирование плазмид, несущих nif-гены, позволяет пе­редавать способность к фиксации азота организмам, не облада­ющим этим свойством. Среди бактерий, кроме Е. , такой пе­ренос осуществлен для бактерий Salmonella typhimurium, Erwinia herbicola и других. Однако подобные манипуляции могут приво­дить к нежелательным эффектам. Так, перенос генов в штамм Erwinia (бактерии, вызывающие гниение растений) может уси­лить его патогенное действие. Кроме того, существует вероятность случайного переноса вместе с nif-генами каких-то нежелательных генов.

В настоящее время внимание ученых привлекают проблемы вве­дения генов азотфиксации в клетки растений, создания ризоценозов между небобовыми растениями (особенно злаками) и азотфиксирующими организмами, повышения мощности корневой систе­мы бобовых растений для увеличения на ней количества клубень­ков. Кроме того, предполагается создание новых азотфиксирующих систем путем введения азотфиксирующих микроорганизмов в каллусные ткани растений с последущим образованием из них растений-регенерантов, а также повышение эффективности фиксации азота путем воздействия на гены, контролирующие этот процесс.

Наиболее интересна первая проблема — введение nif-генов в клетки растений. Однако ее решение сопряжено с рядом трудно­стей. Основная — разрушение нитрогеназы под воздействием кис­лорода. У азотфиксирующих микроорганизмов существует ряд при­способлений, защищающих бактерии от свободного кислорода. Среди них присутствие в клетках клубеньков лешглобина — гем- содержащего белка, который встраивается в мембрану бактероида (увеличенной в размере бактериальной клетки, характеризующей­ся наибольшей способностью к фиксации азота) и регулирует по­ступление кислорода. Легоглобин кодируется в геноме раститель­ной клетки-хозяина, но его синтез начинается только после про­никновения бактерий в эту клетку. У цианобактерий механизм за­щиты нитрогеназы от кислорода иной. Азотфиксация идет в гете­роцистах, а фотосинтез — в обычных клетках. Поэтому кислород, выделяющийся в процессе фотосинтеза, не ингибирует фиксацию азота. Введение только nif -генов в какую-то растительную клетку не решает проблемы. Если нитрогеназа будет синтезироваться в этой клетке, в частности в клетках злаков, то она разрушится под действием кислорода, присутствующего в клетке. Кроме того, сама клетка, в которую переносят гены азотфиксации, может быть не приспособлена к синтезу и расходованию большого количества энергии, которое требуется для фиксации азота.

Таким образом, более перспективно повышение эффективно­сти фиксации азота в уже существующих природных системах за счет воздействия на гены, контролирующие этот процесс, а так­же увеличение мощности корневой системы бобовых растений и создание новых азотфиксирующих систем с помощью методов клеточной инженерии.

5.6. Изменение качества плодов

В настоящее время найдены способы регулирования сроков созревания плодов с помощью методов генетической инженерии. Для этого используют метод создания антисмысловой РНК, ко­торый позволяет управлять работой интересующего гена. В рас­тениях ген PG контролирует синтез полигалактуроназы — фер­мента, который участвует в разрушении пектина. Данный фер­мент синтезируется в период созревания плодов томата, они ста­новятся мягкими, что значительно сокращает срок их хранения. Отключение гена PG позволяет получить растения с новыми свойствами — увеличенным сроком хранения и более высокой ус­тойчивостью к грибным заболеваниям. Эту же технологию мож­но применить для регулирования активности другого гена — гена EFE, продуктом которого является фермент, участвующий в биосинтезе этилена — фитогормона, одной из функций которого слу­жит ускорение созревания плодов. Отключение данного гена так­же может увеличить срок хранения плодов.

5.7. Устойчивость растений к гербицидам

В сельском хозяйстве широко используют гербициды — хими­ческие соединения, применяемые для уничтожения сорной рас­тительности. Гербициды широкого спектра действия могут не только уничтожать сорняки, но и угнетать рост культурных рас­тений. В связи с этим возникает необходимость в создании рас­тений, устойчивых к данным веществам. Существует два подхода к решению этой проблемы: прямая селекция устойчивых к гер­бицидам мутантных форм растений, или мутантных клеточных штаммов (клеточная селекция), и генно-инженерный метод, ко­торый состоит во введении в растения генов гербицид-резистент­ности растительного или бактериального происхождения.

Изучение механизмов устойчивости служит основой для созда­ния трансгенных растений. Оно включает четыре основных эта­па: выявление мишеней действия гербицидов в клетке растений; отбор растений, устойчивых к данному гербициду в качестве ис­точника генов резистентности; идентификация и клонирование этих генов; изучение их экспрессии для использования в трансгенных конструкциях.

Благодаря использованию методов генетической инженерии были созданы новые, устойчивые к различным гербицидам сель­скохозяйственные культуры. В геном этих культур вводились мутантные гены, кодирующие синтез ферментов, на которые гербициды (атразин, бромоксилин, имидазол) не оказывают негативного действия. Например, растения лядвенца рогатого (Lotus corniculatus) были трансформированы с помощью штам­ма А281/рСВЕ21. Эта бактерия содержит плазмиду с встроенным геном bar, кодирующим фермент, придающий устойчивость к гер­бициду биалофосу. Трансгенные растения содержали ген bar и были невосприимчивы к гербициду (А. М. Стефанович, Г. Н. Ралдугина, 1999). Однако в тканях таких растений наблюдается на­копление гербицидов, и использовать эти растения можно толь­ко в технических целях. Вместе с тем было показано, что введе­ние генов, кодирующих другие ферменты, позволяет проводить де­токсикацию гербицидов, создавая таким образом растения, при­годные в пищу. Так, детоксикация действующего вещества герби­цида 2,4-D осуществляется при переносе в растение гена монооксигеназы, глифосата — при введении гена фосфонатазы, бромоксилина — гена нитрилазы.

5.8. Устойчивость растений к фитопатогенам и насекомым

Необходимость создания растений, устойчивых к фитопатоге­нам, связана с тем, что насекомые-вредители, вирусные и другие заболевания служат причиной значительного снижения урожай­ности сельскохозяйственных культур.

Наибольший урон растениям наносят грибные, бактериальные и вирусные патогены, насекомые-вредители. В растении существу­ют защитные механизмы, которые в большей или меньшей степе­ни (в зависимости от устойчивости растений) начинают действо­вать в ответ на проникновение фитопатогенов в клетку. Во-первых, начинается синтез соединений, вызывающих гибель патогенов. Примером могут служить специфические белки PRP (pathogen related proteins). Из них наиболее изучены ферменты хитиназы и бета-1,3-глюконазы, которые угнетают рост грибов и некоторых ви­дов бактерий, разрушая их клеточные стенки. Во-вторых, могут со­здаваться структурные барьеры, препятствующие распространению инфекции. Это достигается благодаря лигнификации клеточных стенок. Той же цели — защите клеток — служит присутствие в кле­точных стенках белков-экстенсинов и олигосахаридов.

Применение методов генетической инженерии, использующих естественные защитные механизмы, позволяет получать трансген­ные растения, устойчивые к грибной, бактериальной и вирусной инфекции. Так, гены хитиназы и глюконазы кодируются одиноч­ными генами. Благодаря этому были получены трансгенные рас­тения табака и турнепса, в состав генома которых ввели ген хи­тиназы. Лабораторные и полевые испытания выявили большую устойчивость трансгенных растений. В растения томатов был вве­ден ген защитных пептидов редьки (дефензинов) rs, отвечающих за устойчивость к фитопатогенным грибам. Наконец, перспектив­ны клонирование и перенос генов, кодирующих специфические белки (small antibiotic-like proteins), содержащиеся в семенах мно­гих растений. Эти белки защищают семена в период покоя и во время прорастания от грибных и бактериальных инфекций.

Другой подход к получению трансгенных растений, устойчи­вых к вирусной инфекции, состоит во введении в геном исходных растений гена оболочки вируса. Это приводит к ингибированию размножения вируса и снижению инфицированности. Благодаря такому подходу был получен стойкий антивирусный эффект у ра­стений табака, трансформированных геном оболочки вируса та­бачной мозаики (ВТМ).

Еще одна группа методов получения трансгенных растений, ус­тойчивых к действию фитовирусов, включает введение и экспрессию генов антивирусных антител, вирусных сателлитных РНК. Интересный эффект дало введение в геном растений гена чело­веческого интерферона JFN — одного из ключевых белков индук­ции иммунитета у млекопитающих. С помощью вируса мозаики цветной капусты геном интерферона были трансформированы растения турнепса, табака, картофеля, что повысило устойчивость этих растений к вирусным заболеваниям.

Вполне традиционным для придания устойчивости к насеко- мым-вредителям стало внесение в растения гена Bt бактерий Bacillus thurengiensis. Этот ген отвечает за синтез белка протокси­на, который при попадании в кишечник личинок насекомых раз­рушается. Продукт данного ферментативного расщепления — 5-эндотоксин — вызывает гибель насекомых. Интерес к этой груп­пе белков вызван их широким спектром действия. Найдены но­вые классы эндотоксинов, которые токсичны к клещам, немато­дам, одноклеточным паразитирующим микроорганизмам и т.д. Более того, в настоящее время сконструирован искусственный ген Bt, более эффективный, с более широким спектром устойчивос­ти по сравнению с природным геном.

Другой путь повышения устойчивости растений к вредителям, в частности к фитопатогенным грибам, — это экспрессия в клет­ках растений генов — ингибиторов протеиназ. Для данной цели перспективно использование гетерологичных генов растений, так как многие ткани и органы растений содержат ингибиторы, спе­цифически настроенные против протеиназ насекомых и грибов, но безвредных для человека и животных.

Еще одно направление создания трансгенных устойчивых ра­стений связано с повышением их иммунитета. У устойчивых ра­стений в ответ на атаку патогенов происходит изменение метаболизма: накапливаются перекись водорода, салициловая кислота, фитоалексины — соединения, выполняющие защитную роль в растении. Поэтому существенное увеличение с помощью измене­ния генома уровня салициловой кислоты и других соединений в ответ на проникновение фитопатогена может стать перспектив­ным для получения устойчивых растительных организмов.

5.9. Устойчивость растений к абиотическим стрессам

Адаптация растений в природе и, следовательно, их способ­ность к выживанию при неблагоприятных условиях среды обес­печиваются тремя способами. Во-первых, физиологические ме­ханизмы, позволяющие растениям избежать неблагоприятные воздействия (например, период покоя). Во-вторых, адаптация осу­ществляется благодаря морфологическим приспособлениям: толстому слою кутикулы на листьях, уменьшению листовой поверх­ности, ее опушению, которые предотвращают излишнюю потерю влаги растениями. В-третьих, негативное влияние внешней среды может быть преодолено с помощью изменений метаболизма. Именно этот последний адаптационный механизм наиболее дос­тупен для генно-инженерных исследований. Например, известно, что при водном стрессе у высших растений основным защитным механизмом, связанным с изменением метаболизма, является накопление в клетках пролина, глицинбеатина и других осмопротекгоров.

Экспериментально было показано, что стрессовый ответ у бак­терий и высших растений выражается сходно. И у растений, и у бактерий начинается усиленный синтез молекул осмопротекто­ров, механизм действия которых состоит в установлении осмоти­ческого баланса между цитоплазмой и окружающей средой, а так­же стабилизации белковых молекул. В бактериях биосинтез про­лина хорошо изучен, известны гены, кодирующие ферменты этого процесса. Избирательная экспрессия генов осмопротекторов мо­жет привести к увеличению адаптационных качеств растения и, следовательно, к увеличению его продуктивности. Поэтому следующим шагом на пути создания устойчивых к стрессам рас­тений было клонирование бактериальных генов, получение век­торных конструкций на основе Ti-плазмиды и введение их в рас­тения. Полученные трансгены синтезировали и накапливали пролин в 4—6 раз интенсивнее, чем обычные растения. Трансгенные побеги могли укореняться и расти при концентрации соли в сре­де 20 г/л (350 мМ).

У растений адаптация к низким температурам сопряжена с многочисленными физиологическими изменениями. При этом накапливаются растворимые вещества, понижающие осмотиче­ский потенциал клеток и уменьшающие вероятность образования крупных кристаллов льда. Кроме того, синтезируется большое количество белков с повышенным содержанием сульфгидрильных групп (-SH), которые обладают особо высокой способностью к гидратации, а гидратационная вода, как известно, практически не замерзает. Однако повышение устойчивости растений к замерза­нию с помощью методов генной инженерии началось с измене­ния генома не растений, а бактерий. Исследователи Колорадского университета (США) выяснили, что повреждению растений при замерзании способствуют бактерии эпифитной (поверхностной) микрофлоры Pseudomonas syringae и Erwinia herbicola, белки ко­торых служат центрами кристаллизации. Если обезвредить бакте­рии стрептомицином, то растения не замерзают при температуре -8 С. Но стрептомицин дорог и вреден, поэтому выгоднее было изменить генетику данного штамма бактерий, вырезав из генома определенный ген. Растения, инфицированные мутантным штам­мом P. syringae, росли при отрицательной температуре. Однако оказалось, что бактерии мутантного штамма более живучи и спо­собны вытеснить природный штамм, который, попадая в верхние слои атмосферы, способствует кристаллизации атмосферной вла­ги. Вероятно, уничтожение природного штамма могло бы приве­сти к экологической катастрофе.

Следует отметить, что работы по генетической инженерии, воз­можности манипулирования генами растений представляют ог­ромный интерес для фундаментальных исследований. Эти рабо­ты позволяют изучать основы молекулярной и клеточной биоло­гии растительной клетки, глубинные механизмы процессов, про­исходящих в ней. Вместе с тем нельзя не задуматься о своевре­менности прикладного применения результатов генно-инженер­ных исследований.