L лизиндекарбоксилазная среда инструкция по применению

Создайте свою лабораторию

Выбираете оборудование?

Поможем с выбором, подберем аналоги и предложим лучшие цены. Возможен лизинг

Выбираете оборудование?

Поможем с выбором, подберем аналоги и предложим лучшие цены. Возможен лизинг

Приложение В (обязательное)

Состав и приготовление питательных сред и реактивов

В.1 Забуференная пептонная вода

В. 1.1 Состав:
— пептон — 10,0 г;
— хлористый натрий — 5,0 г;
— двузамещенный фосфорнокислый натрий 12-водный (Na2HPО4 • 12Н2О) — 9,0 г;
— однозамещенный фосфорнокислый калий (КН2РО4) — 1,5 г;
— вода — 1000 см3.

В.1.2 Приготовление
При нагревании компоненты растворяют в воде. Устанавливают такой рН, чтобы после стерилизации он составлял (7,0 ± 0,2) при температуре 25 °С. Среду разливают во флаконы подходящей вместимости с учетом добав¬ления необходимой навески продукта. Если навеска равна 25 г, то забуференную пептонную воду разливают по 225 см3. Стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре (121 ± 1) °С.

В.2 Среда Раппапорта-Вассилиадиса с соей (RVS-бульон)
В.2.1 Раствор А
В.2.1.1 Состав:
— ферментативный гидролизат сои — 5,0 г;
— хлористый натрий — 8,0 г;
— фосфорнокислый однозамещенный калий (КН2РО4) -1,4 г;
— фосфорнокислый двузамещенный калий (К2НРО4) — 0,2 г;
— вода — см3.
В.2.1.2 Приготовление
Компоненты растворяют в воде при нагревании до температуры около 70 °С. Раствор готовят за день до приготовления RVS-бульона.

В.2.2 Раствор В
В.2.2.1 Состав:
— хлористый магний 6-водный (MgCI2 ∙ 6Н2О) — 400 г;
— вода — 1000 см3.
В.2.2.2 Приготовление
Хлористый магний растворяют в воде. Поскольку эта соль очень гигроскопична, рекомендуется из новой открытой упаковки растворять ее по определенной схеме. Например, к 250 г хлористого магния 6-водного добавляют 625 см3 воды, получая раствор объемом 788 см3 массовой концентрации 31,7 г/100 см3. Состав раствора соответствует В.2.2.1. Раствор переносят в бутылку из темного стекла с притертой пробкой и хранят при комнатной темпе-ратуре не более двух лет.

В.2.3 Раствор С
В.2.3.1 Состав:
— малахитовый зеленый оксалат — 0,4 г;
— вода — 100 см3.
В.2.3.2 Приготовление
Малахитовый зеленый оксалат переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят водой до метки. Раствор переносят в бутылку из темно¬го стекла, хранят при комнатной температуре не более 8 мес.

В.2.4 Готовая среда
В.2.4.1 Состав:
— раствор А (см. В.2.1) — 1000 см3;
— раствор В (см. В.2.2) — 100 см3;
— раствор С (см. В.2.3) — 10 см3.
В.2.4.2 Приготовление
Прибавляют к 1000 см3 раствора А 100 см3 раствора В и 10 см3 раствора С. Устанавливают такой рН, чтобы после стерилизации он составлял (5,2 ± 0,2). Перед использованием среду разливают по пробиркам по 10 см3. Сте¬рилизуют 15 мин в автоклаве при температуре (115 ± 1) °С. Рекомендуется использовать среду в день приготовления. При необходимости допускается готовую среду хранить по ГОСТ 10444.1.
Следует учитывать, что на этой среде не растет S. Typhi.
Примечание — Конечный состав среды: ферментативный гидролизат сои – 4,5 г/дм3; хлористый натрий – 7,2 г/дм3; фосфорнокислый однозамещенный калий – 1,26 г/дм3, фосфорнокислый двузамещенный калий – 0,18 г/дм3; хлористый магний безводный – 13,4 г/дм3 или хлористый магний 6-водный – 28,6 г/дм3; малахитовый зеленый оксалат – 0,036 г/дм3.

В.3 Селенитовая среда
Селенитовую среду готовят из двух растворов.
В.3.1 Раствор 1
В. 3.1.1 Состав:
— пептон – 5,0 г;
— двузамещенный фосфорнокислый натрий безводный – 7,0 г;
— однозамещенный фосфорнокислый натрий – 3,0 г;
— лактоза – 4,0 г;
— вода – 1000 см3.

В.3.1.2 Приготовление
При нагревании растворяют компоненты в воде. Путем изменения соотношения фосфатных солей устанавливают рН (7,0 ± 0,1). Среду разливают по 100 см3 в колбы или флаконы и стерилизуют текучим паром по 30 мин в течение двух дней или при температуре (112 ± 1) °С в течение 30 мин.

В.3.2 Раствор 2
В. 3.2.1 Состав:
— кислый селенистокислый натрий (NaHSeO3) — 10,0 г;
— вода — 100 см3.
Кислый селенистокислый натрий растворяют с соблюдением правил асептики в стерильной дистиллированной воде. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.

В.3.3 Готовая среда
В.3.3.1 Состав:
раствор 1 – 100 см3:
раствор 2-4 см3.
В.3.3.2 Приготовление среды
К раствору 1 прибавляют раствор 2, среду разливают по 10 см3 в пробирки.
Стерилизация приготовленной среды не допускается, так как при этом происходит редукция кислого селенистокислого натрия, выпадает осадок красного цвета и среда становится непригодной для использования.
Селенитовую среду выпускают в сухом виде и готовят по инструкции, указанной на этикетке.

В.4 Тетратионатный бульон Мюллер-Кауфман
В.4.1 Основа среды
В. 4.1.1 Состав:
— мясо-пептонный бульон — 100 см3:
— углекислый кальций — 4,5 г.

В.4.1.2 Приготовление среды
В мясо-пептонный бульон, приготовленный по ГОСТ 10444.1, помещают стерильный углекислый кальций. Углекислый кальций стерилизуют по ГОСТ 10444.1.
Приготовленную основу стерилизуют в автоклаве при температуре (121 ± 1)°С в течение 20 мин.

В.4.2 Раствор 1
В. 4.2.1 Состав:
— гипосульфит натрия (Na2S2О3 ∙ 5Н2О) – 50 г;
— вода — до 100 см3.
В.4.2.2 Приготовление
Гипосульфит натрия помещают в колбу вместимостью 100 см3, растворяют в дистиллированной воде и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор переливают в колбу или флакон и стерилизуют текучим паром в течение 30 мин или при температуре (121 ±1) °С в течение 20 мин. Раствор хранят не более 1 мес при температуре (3 ± 2) °С.

В.4.3 Раствор 2
В. 4.3.1 Состав:
— йодистый калий – 25 г;
— йод кристаллический – 20 г;
— вода — до 100 см3.
В.4.3.2 Приготовление
Йодистый калий помещают в колбу вместимостью 100 см3, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, прибавляют кристаллический йод, растворяют его. Объем раствора доводят дистиллированной водой до метки. Раствор хранят при комнатной температуре в плотно закрытом сосуде из темного стекла.

В.4.4 Раствор 3
В.4.4.1 Состав:
— бриллиантовый зеленый – 0,5 г;
— вода – 100 см3.
В.4.4.2 Приготовление
Бриллиантовый зеленый переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в дистиллированной воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3 мес.

В.4.5 Раствор 4
В.4.5.1 Состав:
— сухая бычья желчь – 10 г
— вода – до 100 см3.
В.4.5.2 Приготовление
Сухую желчь растворяют в 100 см3 дистиллированной воды или используют 100 см3 натуральной желчи. Раствор желчи или натуральную желчь стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение 20 мин. Раствор хранят не более 1 мес при температуре (3 ± 2) °С.

В.4.6 Готовая среда
В.4.6.1 Состав:
— основа среды по В.4.1 – 100 см3:
— раствор 1 – 1 0 см3:
— раствор 2 – 2 см3;
— раствор 3 – 0,2 см3:
— раствор 4 – 5 см3.
В.4.6.2 Приготовление
Указанные растворы прибавляют к основе среды в приведенном выше порядке, перемешивая смесь после каждого прибавления, среду разливают по 10 см3 в пробирки.
Среду используют в день приготовления.
Для повышения селективности среды допускается добавлять к среде раствор новобиоцина натриевой соли из расчета 0,5 см3 раствора новобиоцина натриевой соли на 100 см3 основы среды.

В.4.7 Раствор новобиоцина
В.4.7.1 Состав:
— новобиоцин натриевая соль – 0,04 г;
— вода – 5 см3.
В.4.7.2 Приготовление
Новобиоцин натриевую соль растворяют в дистиллированной воде. Раствор стерилизуют фильтрацией по ГОСТ 26670 через мембранный фильтр размером пор 0,22 мкм, хранят при температуре (3 ± 2) °С в течение четырех недель.

В.5 Ксилоза-лизин-деоксихолатный агар (ХLD-агар)
В.5.1 Основа среды
8.5.1.1 Состав:
— дрожжевой экстракт (порошок) – 3,0 г;
— хлористый натрий (NаС1) – 5,0 г;
— ксилоза – 3,75 г;
— лактоза – 7,5 г;
— сахароза – 7,5 г;
— L-лизин гидрохлорид – 5,0 г;
— тиосульфат натрия – 6,8 г;
— железо III аммоний цитрат – 0 ,8 г;
— феноловый красный – 0,08 г (или 20 см3 раствора, приготовленного по 5.2, если среда состоит из отдельных компонентов);
— деоксихолат натрия – 1,0 г;
— агар – от 9 до 18 г*;
— вода – 1000 см3.
* Зависит от желирующих свойств.
В.5.1.2 Приготовление
При нагревании растворяют дегидратированные компоненты основы или дегидратированную основу в воде при частом помешивании. Доводят до кипения, но не кипятят, избегая перегрева.
Устанавливают рН так, чтобы после прогрева он составлял (7,4 ± 0,2) при температуре 25 °С. Разливают основу в пробирки или флаконы подходящей вместимости. Затем прогревают на кипящей водяной бане около 5 мин.

В.5.2 Раствор фенолового красного
В.5.2.1 Состав:
— феноловый красный – 0,4 г;
— вода – 100 см3.
В.5.2.2 Приготовление
Феноловый красный переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в дистиллированной воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре.
В.5.3 Приготовление чашек со средой
Среду после прогрева переносят в водяную баню при температуре от 44 °С до 47 °С, перемешивают и разливают в чашки, дают затвердеть. Перед использованием среду в чашках предпочтительно с открытой крышкой и поверхностью среды вниз подсушивают в шкафу с температурой от 37 °С до 55 °С до тех пор, пока поверхность среды не станет сухой. Допускается хранить чашки со средой при температуре (3 ± 2) °С не более пяти дней.

В.6 Дифференциально-диагностические среды
В.6.1 Висмут-сульфит агар (агар Вильсон-Блера).
В. 6.2 Среда Плоскирева.
В.6.3 Среда Эндо.
В.6.4 Среда Левина.
Среды готовят по инструкции, указанной на этикетке.

В.6.5 Бриллиантовый зеленый агар
В. 6.5.1 Состав:
— дрожжевой экстракт – 3 г:
— пептон – 10 г;
— хлористый натрий – 5 г;
— лактоза – 10 г;
— сахароза – 10 г;
— феноловый красный – 0,08 г (или 20 см3 раствора, приготовленного по В. 5.2, если среда состоит из отдельных компонентов);
— агар – 20 г;
— бриллиантовый зеленый — 0,0125 г (или 2,5 см3 раствора, приготовленного по В.4.4);
— вода – 1000 см3.
В.6.5.2 Приготовление
При нагревании растворяют дегидратированные компоненты основы или дегидратированную основу в воде при частом помешивании. Доводят до кипения, кипятят 1 мин.
Устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял (6,9 ± 0,1) при температуре 25 °С. Разливают среду во флаконы подходящей вместимости. Стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре (121 ± 1) С. Охлаждают до температуры от 45 °С до 50 °С и разливают в чашки Петри.

В.7 Питательный агар
В.7.1 Состав:
— мясной экстракт – 3 г;
— пептон – 5 г;
— агар – от 9 до 18 г;
— вода – 1000 см3.
В.7.2 Приготовление
Компоненты растворяют в воде при нагревании. Устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял (7,4 ± 0,2) при температуре 25 °С. Переносят питательную среду в пробирки или флаконы, стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре (121 ±1) °С.
В.7.3 Приготовление чашек с питательным агаром
Переносят приблизительно 15 см3 расплавленной среды в стерильные чашки Петри и поступают по В.5.3.

В.8 Мясо-пептонный агар
Мясо-пептонный агар готовят по ГОСТ 10444.1 или используют ГРМ-агар. ГРМ-агар готовят по инструкции, указанной на этикетке.

В.9 Мясо-пептонный бульон с глюкозой
Мясо-пептонный бульон с глюкозой готовят по ГОСТ 10444.1. Для посевов используют среду, разлитую в пробирки по 6-7 см3.

В.10 Среды с углеводами (среды Гисса)
Среды с углеводами (среды Гисса) готовят по ГОСТ 10444.1 или используют сухие среды с углеводами, которые готовят по инструкции, указанной на этикетке.

В.11 Трехсахарный железистый агар (TSI-arap)
В. 11.1 Состав:
— мясной экстракт – 3,0 г;
— дрожжевой экстракт – 3,0 г;
— пептон – 20,0 г;
— хлористый натрий (NaCl) – 5,0 г;
— лактоза – 10,0 г;
— сахароза – 10,0 г;
— глюкоза – 1,0 г;
— железо (III) цитрат – 0,3 г;
— тиосульфат натрия – 0,3 г;
— феноловый красный – 0,024 г (или 6 см3 раствора, приготовленного по В.5.2, если среда состоит из отдельных компонентов);
— агар – от 9 до 18 г;
— вода – 1000 см3.
В.11.2 Приготовление
При нагревании растворяют компоненты или дегидратированную основу среды в воде. Устанавливают такой рН, чтобы после стерилизации он составлял (7,4 ± 0,2) при температуре 25 °С. Переносят среду в пробирки по 7-8 см3. Стерилизуют 15 мин в автоклаве при (121 ± 1) °С. Затем пробирки оставляют в наклонном положении так, чтобы высота столбика среды составляла около 2,5 см, а скошенная поверхность над ним – 5 см.
Допускается использование агара Клиглера или среды Олькеницкого. Среды готовят по инструкциям, указанным на этикетках.

В.12 Агар с мочевиной (агар Кристенсена)
В 12.1 Основа среды
В.12.1.1 Состав:
— пептон – 1,0 г;
— глюкоза – 1,0 г;
— хлористый натрий (NaCl) – 5,0 г;
— однозамещенный фосфорнокислый калий (КН2РО4) – 2,0 г;
— феноловый красный — 0,012 г (или 3 см3 раствора, приготовленного по В.5.2, если среда состоит из отдельных компонентов);
— агар – от 9 до 18 г;
— вода – 1000 см3.
В.12.1.2 Приготовление
При нагревании растворяют компоненты или дегидратированную основу среды в воде. Устанавливают такой pH, чтобы после стерилизации он составлял (6,8 ± 0,2) при температуре 25 °С. Основу среды в определенных объемах разливают в колбы или флаконы и стерилизуют в автоклаве при температуре (121 ±1) °С в течение 15 мин.

В.12.2 Раствор мочевины
В. 12.2.1 Состав:
— мочевина – 40 г;
— вода до конечного объема – 100 см3.
В.12.2.2 Приготовление
Мочевину помещают в колбу вместимостью 100 см3, растворяют в воде, объем раствора доводят водой до метки. Раствор мочевины стерилизуют фильтрацией по ГОСТ 26670 через фильтры с размером пор 0,22 мкм или текучим паром в течение 30 мин.

В.12.3 Раствор фенолового красного
В.12.3.1 Состав и приготовление — по В.5.2.
В.12.4 Готовая среда
В.12.4.1 Состав:
— основа (см. В.12.1) – 950 см3;
— раствор мочевины (см. В.12.2) – 50 см3.
В.12.4.2 Приготовление
Прибавляют с соблюдением правил асептики раствор мочевины к основе, предварительно расплавленной и охлажденной до температуры от 44 °С до 47 °С. Разливают готовую среду в стерильные пробирки 7-8 см3. После стерилизации среду скашивают по В.11.2.

В.13 L-лизиндекарбоксилазная среда
В.13.1 Состав:
— L-лизин моногидрохпорид – 5,0 г;
— дрожжевой экстракт – 3,0 г;
— глюкоза – 1,0 г;
— бромкрезоловый пурпуровый – 0,015 г (или 5 см3 раствора, приготовленного по В.13.3);
— вода – 1000 см3.
В.13.2 Приготовление
Компоненты растворяют в воде при нагревании.
Устанавливают pH так, чтобы после стерилизации он составлял (6,8 ±0,2) при температуре 25 °С.
Переносят среду в пробирки по 2-5 см3.
Стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре (121 ±1) °С.

В.13.3 Раствор бромкрезолового пурпурового
В. 13.3.1 Состав:
— бромкрезоловый пурпуровый – 0,3 г;
— вода – 100 см3.
В.13.3.2 Приготовление
Бромкрезоловый пурпуровый переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят водой до метки. Раствор хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3 мес.

В.14 β-галактозидазный реактив
8.14.1 Буферный раствор
В. 14.1.1 Состав:
— фосфорнокислый однозамещенный натрий (NaH2PО4) — 6,9 г;
— гидроксид натрия (NaOH) концентрации 10 моль/дм3 — около 3 см3;
— вода до конечного объема — 50 см3.
В.14.1.2 Приготовление
Растворяют фосфорнокислый однозамещенный натрий приблизительно в 45 см3 воды в мерном флаконе. Устанавливают рН с помощью раствора гидроксида натрия (7,0±0,2) при температуре 25 °С. Добавляют воду до объема 50 см3.

В.14.2 ONPG-раствор
В. 14.2.1 Состав:
— о-нитрофенил β-D-галактопиранозид (ONPG) — 0,08 г;
— вода – 15 см3.
В.14.2.2 Приготовление
Растворяют ONPG в воде температурой около 50 °С. Раствор охлаждают.

В.14.3 Готовый реактив
В.14.3.1 Состав:
— буферный раствор (см. В.14.1) – 5 см3;
— ONPG-раствор (см. В. 14.2) – 15 см3.
В.14.3.2 Приготовление
Готовят свежий раствор, прибавляя буферный раствор к ONPG-раствору.

В.15 Среда и реактивы для реакции Фогес-Проскауера (VP)
В.15.1 VP-среда
В. 15.1.1 Состав:
— пептон — 7 г;
— глюкоза — 5 г;
— фосфорнокислый двузамещенный калий (К2НРО4) — 5 г;
— вода — 1000 см3.
В.15.1.2 Приготовление
Компоненты растворяют в воде при нагревании. Устанавливают такой рН, чтобы после стерилизации он составлял (6,9 ± 0,2) при температуре 25 °С. Среду разливают в пробирки по 3 см3. Стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре (121 ±1) °С.

В.15.2 Раствор креатина (N-амидиносаркозина)
В. 15.2.1 Состав:
— креатин моногидрат — 0,5 г;
— вода — 100 см3.
В.15.2.2 Приготовление
Креатин моногидрат растворяют в воде.

В.15.3 1-нафтол, спиртовой раствор
В.15.3.1 Состав:
— 1-нафтол — 6 г;
— спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья объемной долей 96 % -100 см3.
В.15.3.2 Приготовление
Растворяют 1-нафтол в этаноле.

В.15.4 Раствор гидроксида калия
В. 15.4.1 Состав:
— гидроксид калия (КОН) — 40 г;
вода — 100 см3.
В.15.4.2 Приготовление
Гидроксид калия растворяют в воде.

В.16 Реактивы для индольной реакции
В.16.1 Реактив Ковача
В. 16.1.1 Состав:
— 4-диметиламинобензальдегид – 5 г;
— соляная кислота плотностью ρ = 1,18 г/см3 + 1,19 г/ см3 – 25 см3;
— 2-метилбутан-2-ол (изобутиловый спирт) — 75 см3.
В.16.1.2 Приготовление
Компоненты перемешивают.

В.16.2 Реактив Эрлиха
В. 16.2.1 Состав:
— парадиметиламинобензальдегид – 1 г;
— этиловый спирт объемной долей 96% — 95 см3;
— соляная кислота плотностью ρ = 1,18 г/см3 + 1,19 г/см3 – 80 см3.
В.16.2.2 Приготовление
Компоненты перемешивают.

В.17 Триптон/триптофановая среда
В.17.1 Состав:
— триптон — 10 г;
— хлористый натрий (NаС1) – 5 г;
— DL-триптофан – 1 г;
— вода — 1000 см3.
В.17.2 Приготовление
Компоненты растворяют в горячей воде. Устанавливают такой рН, чтобы после стерилизации он составлял (7,5 ± 0,2) при температуре 25 °С. Разливают среду по 5 см3 в пробирки. Стерилизуют 15 мин в автоклаве при темпе¬ратуре (121±1) °С.

В.18 Бульон Хоттингера
Бульон Хоттингера готовят по ГОСТ 10444.1. Для посевов используют среду, разлитую в пробирки по 6-7 см3.

В.19 Мясо-пептонный бульон с 0,05 % L-триптофана
В. 19.1 Состав:
— L-триптофан – 0,05 г;
— мясо-пептонный бульон — 100 см3.
В.19.2 Приготовление
L-триптофан растворяют в мясо-пептонном бульоне, приготовленном по ГОСТ 10444.1, разливают в пробирки по 6-7 см3 и стерилизуют при температуре (121 ±1) °С в течение 20 мин.

В.20 Полужидкий питательный агар
В.20.1 Состав:
— мясной экстракт – 3,0 г;
— пептон – 5,0 г;
— агар – от 4 до 9 г*;
— вода – 1000 см3.
* Зависит от желирующих свойств.
В.20.2 Приготовление
Компоненты растворяют в воде при нагревании. Устанавливают такой рН, чтобы после стерилизации он составлял (7,0 ± 0,2) при температуре 25 °С. Разливают среду во флаконы подходящей вместимости. Стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре (121 ± 1) °С.
В.20.3 Приготовление пробирок с агаром
В стерильные пробирки наливают по 6-7 см3 свежеприготовленного агара.

В.21 Полужидкий мясо-пептонный агар
Готовят по ГОСТ 10444.1 также, как мясо-пептонный агар, но при приготовлении добавляют 4,0-9,0 г агара на 1 дм3 мясо-пептонного бульона, перед стерилизацией среду разливают по 6-7 см3 в пробирки.

В.22 Физиологический раствор
В.22.1 Состав:
— хлористый натрий (NаCl) – 8,5 г;
— вода – 1000 см3.
В.22.2 Приготовление
Хлористый натрий растворяют в воде. Устанавливают такой рН, чтобы после стерилизации он составлял (7,0 ± 0,2) при температуре 25 °С. Разливают во флаконы подходящей вместимости, стерилизуют в автоклаве при температуре (121 ± 1) °С в течение 15 мин.
Допускается использование готовых и дегидратированных, в том числе хромогенных, питательных сред аналогичного состава и зарегистрированных на территории государств, принявших стандарт.