Пункты инструкции при приготовлении микропрепарата крови для изучения под микроскопом

Задание № 27195

Нашли ошибку в задании? Выделите фрагмент и нажмите Ctrl + Enter.

Методика приготовления постоянных микропрепаратов

Как понятно из заголовка отличие временного препарата, который может храниться  относительно не долгий отрезок времени, постоянный препарат может храниться многие годы.

Существуют готовые наборы для изготовления постоянных препаратов,  один из таких наборов изображен ниже.

Конечно, данный набор имеет свои ограничения для изготовления препаратов.

Обязательным  условием для долгосрочного хранения препарата из растительного или животного материала является его фиксация.  Фиксирующих жидкостей много, самые доступные из  них:  этиловый спирт  и продающийся в аптеках препарат на основе формалина (Формидрон) Состав: 100 мл препарата содержат 10 г раствора формальдегида в пересчете на 37 % формальдегид; вспомогательные вещества: спирт этиловый 96 %, одеколон, вода очищенная.

Препарат ФОРМИДРОН, может быть использован для создания архива биологических объектов, вспомогательные вещества входящие в аптечный препарат, не сколько не мешают  в сохранении объекта.

ВНИМАНИЕ ФОРМАЛЬДЕГИД ОБЛАДАЕТ РАЗДРАЖАЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ.

Если на дне банки с 40 % формалином образовался осадок белого цвета (параформальдегид), то его можно растворить, подогрев до 70-80 °С (в вытяжном шкафу! или на открытом воздухе), и использовать для фиксации.

Спирт-формол по Шафферу — 10%  формалин, который готовят из 1 части  40% формалина и 2-3 частей 96 % спирта. Продолжительность фиксации 24-48 ч. Дальнейшая промывка в воде не требуется, и материал сразу же помещают в 96 % спирт. Выпадение белого осадка никак не сказываеться на свойстве фиксатора.

ПРАВИЛА РАБОТЫ С ФИКСАТОРАМИ

Практически все фиксаторы относятся к токсичным веществам поэтому необходимо соблюдать правила техники безопасности при работе с реактивами.

Фиксация необходима с целью остановки (прекращения) жизнедеятельности клеток. Для этого объект помещают в соответствующий фиксатор  на время от нескольких минут до нескольких часов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПРЕПАРАТА ПОД ПОКРОВНОЕ СТЕКЛО

Большинство используемых в цитологии и гистологии красителей представляет собой водные растворы. Чтобы сделать временный препарат, срез, вынув из водного раствора красителя, промывают и заключают в глицерин. Приготовить постоянный препарат несколько сложнее: необходимо покрыть срезы покровным стеклом, заключив их в прозрачную затвердевающую среду. Можно, ополоснув срезы дистиллированной водой, капнуть на них разогретый раствор желатины. Но большую сохранность и лучшее качество препаратов можно получить, заключив их в канадский бальзам (прозрачную смолу пихты с показателем преломления n= 1,535). Поскольку канадский бальзам не смешивается с водой, но растворим в ксилоле  (толуоле, бензоле), создается необходимость провести препарат по «проводке» для срезов, но в направлении, противоположном тому, в которое стекла велись для удаления парафина и подготовке к окраске. При этом нужно помнить, что даже незначительное присутствие воды в срезе сделает препарат мутным, непригодным для изучения. Поэтому переносить срезы по проводке от воды к толуолу надо медленно, погружая стекло в стаканчик со спиртом или толуолом на 2—3 мин. Схема проведения срезов может быть следующей:     

дистиллированная вода — ополоснуть,

спирт 70%-ный — 2 мин,

96%-ный — 2 мин,

100%-ный —3 мин,

Ксилол I — 2 мин,

Ксилол II — 3—5 мин.

Надо иметь в виду, что некоторые красители легко вымываются из препаратов как в воде, так и в спиртах. Поэтому в некоторых случаях приходится избегать промывки препаратов и проведения через спирты низких концентраций. Чтобы достигнуть обезвоживания, приходится препараты осторожно промокать фильтровальной бумагой, опуская их сразу в 96%- или 100%-ный спирт, можно заменять этиловые спирты ацетоном или изоамиловым спиртом.

Итак, задача, которая стоит при подготовке препарата для монтирования его под покровное стекло, состоит в том, чтобы, не вымыв красителя, добиться полного обезвоживания среза. Достигается это проводкой по спиртам возрастающей крепости, вплоть до 100%. Обработка срезов ксилолом имеет двоякое значение: с одной стороны, в нем достигается просветление препарата, усиливается его прозрачность (краситель при этом из препарата не вымывается), с другой стороны, создаются благоприятные условия для дальнейшего пропитывания среза канадским бальзамом, который растворим в ксилоле. Само заключение среза под покровное стекло осуществляется быстро, пока на препарате не испарился ксилол. Капля бальзама наносится на покровное стекло (оно должно быть чистым и сухим), и покровное стекло быстро перевертывается над срезом. Можно капать бальзам на предметное стекло на поверхность среза и быстро покрывать его покровным стеклом. Канадский бальзам должен иметь консистенцию растительного масла (или гуще). Через 1—2 дня бальзам застывает.

Вместо канадского бальзама можно использовать синтетическую среду на основе полистирола.

Для этого берут 25г бесцветного полистирола, 5 мл дибутилфталата (пластификатор может быть любой) и доливают ксилолом до 100 мл. Раствор должен иметь консистенцию меда.  Заключение  среза под покровное стекло не отличается, от выше описанного.

Несомненным плюсом синтетического бальзама это инертность и более лучшая сохранность красителей.

Мобильная лаборатория естествоиспытателя

ЛАБОРАТОРИЯ МИКРОСКОПИРОВАНИЯ

1. Приготовление микропрепаратов

Далеко не всё, что есть под рукой, имеет смысл класть на предметный столик и пытаться рассмотреть в окуляр микроскопа. Например, непрозрачные объекты (палец, монета) рассмотреть совсем не удастся, да и для рассматривания вполне достаточно сильной лупы.

Обычно для микроскопирования используют специально приготовленные микропрепараты. При приготовлении микропрепарата берется предметное стекло (размер 25 × 75 мм), на которое помещается рассматриваемый объект; обычно для лучшей сохранности и удобства использования объект накрывается сверху тонким покровным стеклом (размер 18 × 18 мм).

По способу приготовления и времени хранения различают:

• постоянные препараты – объект помещен в прозрачную твердеющую среду (обычно канадский бальзам) и накрыт покровным стеклом; такие препараты могут храниться годами и десятилетиями, однако их приготовление весьма трудоемко (объект должен быть тщательно подготовлен: обезвожен, окрашен и др.);
• временные препараты – объект помещен в жидкую среду (вода, физиологический раствор, глицерин-желатин и др.), такие препараты годны для использования в течение нескольких часов, однако с ними можно проводить опыты (например, заменять воду солевым раствором определенной концентрации, добавлять краситель и др.).

Постоянный препарат

В таблице представлены типы препаратов в зависимости от характера исследуемого объекта.

№	Тип	Описание	Постоянный/ временный	Пример
1	Тотальный препарат	Целый организм или его небольшие части (конечности, ротовой аппарат). Обычно требуют обработки (осветления)	Постоянный, временный
2	Срез	Объект заливается в пластичный материал (парафин, акрил) и после его затвердевания разрезается на тонкие пластины с помощью микротома (приспособления для получения тонких срезов)	Обычно постоянный
3	Мазок	Токослойный препарат без покровного стекла (обычно препарат крови): капля с помощью полированного стекла размазывается по поверхности предметного стекла тонким слоем, высушивается	Временный, реже постоянный
4	Шлиф	Тонкая (толщина 0,03-0,02 мм) пластинка горной породы или другого твердого образца (кости, окаменелости), приклеенная к покровному стеклу	Постоянный

В некоторых случаях временный препарат можно рассматривать непосредственно, не накрывая покровным стеклом. Такой препарат будет практически невозможно рассмотреть резко сразу весь – какая-то часть его будет в фокусе, а остальное – нет. Но если рассматривать такой препарат с малым увеличением микроскопа, можно рассмотреть некоторые интересные объекты.

Микропрепарат клеток мякоти арбуза (без покровного стекла)

Так же в виде открытых временных препаратов можно вырастить кристаллы разных солей (ацетилсалициловой кислоты, или аспирина; медного купороса, или сульфата меди; красной кровяной соли, или гексацианоферрата калия). На предварительно очищенное от пыли и отпечатков пальцев наносится несколько капель водного или спиртового раствора соли (для лучшего качества кристаллов раствор предварительно лучше профильтровать, так как это позволит уменьшить количество точек кристаллизации и получить более крупные и аккуратные кристаллы). Каплям дают высохнуть (можно провести эксперимент с одним из стекол, нагрев его, с целью ускорения выпаривания, а другому дать растворителю испариться, а кристаллам – выпасть самостоятельно). Также можно рассматривать полуготовый микропрепарат на этапе процесса кристаллизации: можно увидеть, как кристалл увеличивается прямо на глазах или как вокруг зародыша твердого вещества возникает течение жидкости из-за разницы концентраций ионов.

Простой и эффектный способ изготовления микропрепаратов без срезов, позволяющий рассмотреть рельеф поверхности изучаемого объекта (например, листа растения, покровов тела насекомого) – метод реплик. При этом берется объект (например, лист растения), и на него наносится тонкий слой прозрачного лака для ногтей (достаточно небольшого пятна 5 × 10 мм). После того, как лак высохнет (примерно через 5-7 минут), к лаковому пятну приклеивается кусок липкой ленты; так реплика отделяется, после чего ее кладут на предметное стекло и рассматривают под микроскопом. 

Реплика поверхности листа, видны устьичные клетки и жилка (микроскоп Микромед С-13, малое увеличение).

1.1. Приготовление временного препарата

Техника приготовления временного препарата хорошо известна по школьным опытам с кожицей лука. Кладем предметное стекло на стол (препараты всегда держат за боковые грани предметного стекла). В центр стекла помещаем 1-2 капли воды и объект исследования Берем покровное стекло за боковые грани и осторожно накрываем им сверху каплю с объектом. Правильнее упереть покровное  стекло одной из граней в предметное и медленно уменьшать угол между стеклами так, чтобы накрыть каплю с объектом. Это уменьшает возможность появления пузырьков воздуха.

Накрывание объекта покровным стеклом

1.2. Приготовление мазка крови

Мазки крови для исследования крови готовят следующим образом.

Шаг	Описание	Фотография
1	Поместите небольшую каплю крови на лежащее на горизонтальной поверхности предметное стекло, с помощью стеклянной капиллярной пипетки (или непосредственно из места укола пальца перенесите выступившую каплю крови на конец стерильного предметного стекла, стараясь не касаться стекла проколотым участком кожи).
2	Чистое шлифованное стекло помещается коротким ребром под углом 45° к предметному стеклу у края капли. Ждем, пока кровь расплывется под ребром стекла.
3	Как только кровь растеклась по ребру, быстрым движением от капли проводим по предметному стеклу. Не следует сильно нажимать на стекло, так как при этом могут разрушиться форменные элементы крови.
4	После приготовления мазок быстро сушат на воздухе до исчезновения влажного блеска, подержав его над абажуром лампы или помахав им в воздухе. Хорошо сделанный мазок тонок, имеет желтоватый цвет и оканчивается «метелочкой». Густо-розовые и красноватые мазки непригодны, так как они слишком толстые и клеточные элементы различить будет сложно.

Изображения и описание с сайта microtome.info/documents/micropreparaty.html.

2. Некоторые особенности микроскопирования

Использование микроскопов на малом и большом увеличении достаточно хорошо известно по школьным опытам и не требует особо сложных навыков.

2.1. Имерсионный объектив

Если в ващем распоряжении имеется микроскоп с иммерсионным объективом (он маркируется 100× МИ и черным кольцом, и имеет подвижную часть объектива, обращаемую к микропрепарату), то у вас есть возможность рассмотреть объекты с большим увеличением (однако для этого имеет смысл использовать мазки).

Порядок работы с объективом масляной иммерсии следующий.

1. Выведите из хода лучей сухой объектив (поверните барабан объективов так, чтобы ни один объектив не был обращен к препарату).
2. На препарат нанесите одну каплю иммерсионного (кедрового) масла; желательно иммерсионным маслом также немного смазать линзу этого объектива.
3. Повернув барабан объективов, введите иммерсионный объектив в ход лучей (до щелчка фиксации).
4. Опустите объектив до соприкосновения с каплей иммерсионного масла, затем, наблюдая в микроскоп, с помощью винтов грубой и точной фокусировки, произведите настройку на резкость.

При работе с иммерсионным объективом потребуется максимальная освещенность. После окончания исследования иммерсионный объектив нужно протереть мягкой оптической тряпочкой или батистовой, слегка смоченной специальной жидкостью для чистки оптики. Важно: любые другие виды объективов протирать нельзя!

Применение вместо кедрового масла других масляных жидкостей не рекомендуется, т. к., если показатель преломления используемой иммерсии (например, вазелинового масла с показателем 1,48162) отличается от показателя преломления кедрового масла (показатель 1,515), возможно снижение контраста, нечеткость изображения, уменьшение разрешающей способности.

2.2. Фотографии в косом освещении и темном поле

Для объемных препаратов (тотальные препараты насекомых, водорослей и др.) интересно использовать освещение, отличное от обычного просвечивающего. Для регулировки освещения в микроскопах используется конденсор – поворотное устройство с отверстиями разного диаметра и расположения. Используя специальные варианты конденсора, можно изменить характер освещения препарата, подчеркнув объем рассматриваемого объекта.

В таблице сравнивается работа с освещением разных типов.

№	Тип освещения	Способ создания	Вид зрачка объектива с вынутым окуляром	Пример
1	Обычное (просвечи-вающее)	Свет проходит через поле зрения равномерно.
2	Косое	Свет проходит через препарат под углом, так как конденсор закрывает часть отверстия. Этого эффекта можно добиться притеняя рукой или другой преградой  часть светового потока перед зеркалом микроскопа
3	Темное поле	Специальный конденсор закрывает центральную часть поля зрения, так что свет проходит с краев. При определенной тренировке такого эффекта также можно добиться, частично притеняя часть светового потока перед зеркалом микроскопа

3. Съемка

Фотографирование настроенного на резкость микропрепарата с помощью камеры планшета особых трудностей не представляет, так как мы непосредственно контролируем то, что именно будем снимать. Настройки камеры планшета также зависят от типа устройства, которое вы используете; так как камера планшета обычно имеет достаточно большую глубину резкости, даже при настройках камеры по умолчанию можно получить вполне качественное изображение.

4. Интернет-ресурсы

Лекция по микроскопированию для студентов:

•  fep.tti.sfedu.ru/russian/ehamt/learn/nano-biology/lek_2.pdf

Простые опыты в домашних экспериментах:

• edu.altami.ru/research-index/

Сайты с историческими микроскопами и микропрепаратами:

• www.victorianmicroscopeslides.com/slides.htm,
• steampunker.ru/blog/interior_design/5342.html,
• bibliodyssey.blogspot.com/2008/08/early-microscopes.html,
• marinni.livejournal.com/749561.html.

Книга Роберта Гука (Robert Hooke) о микроскопировании “Micrographia: Some Physiological Descriptions of Minute Bodies Made by Magnifying Glasses with Observations and Inquiries Thereupon”

• www.gutenberg.org/files/15491/15491-h/15491-h.htm.

Описание методики изготовления микроскопа Гука из бумаги: Nektarios Tsagliotis Build your own microscope: following in Robert Hooke’s footsteps (Сделай свой микроскоп: по следам Роберта Гука) // Science in School, Issue 22, p.29-35.

• www.scienceinschool.org/2012/issue22/microscope.

На этой странице находится вопрос Расположите в правильном порядке пункты инструкции по работе с фиксированным микропрепаратом крови человека?, относящийся к категории
Биология. По уровню сложности данный вопрос соответствует знаниям
учащихся 5 — 9 классов. Здесь вы найдете правильный ответ, сможете
обсудить и сверить свой вариант ответа с мнениями пользователями сайта. С
помощью автоматического поиска на этой же странице можно найти похожие
вопросы и ответы на них в категории Биология. Если ответы вызывают
сомнение, сформулируйте вопрос иначе. Для этого нажмите кнопку вверху.

РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ

О.О. Анисимова, О.Н. Морылева

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

МИКРОСКОПИЯ НАТИВНОЙ КРОВИ

Для медицинских работников различных специальностей, преподавателей и студентов медицинских вузов

2010г.

МОСКВА

Утверждено
Редакционно-издательским советом факультета

повышения квалификации медицинских работников
Университета

Методические указания подготовлены
на факультете повышения квалификации
медицинских работников РУДН

Анисимова О.О., Морылева О.Н.
Лабораторная диагностика. Микроскопия нативной крови: методические указания.

В пособии рассматриваются наиболее актуальные вопросы метода микроскопии нативной крови, указания по методике проведения данного исследования и интерпретации его результатов.

Пособие предназначено для медицинских работников различных специальностей, преподавателей и учащихся медицинских образовательных учреждений.

Фотографии нативной крови, наглядно отражающие содержание методических указаний, опубликованы в пособии «Атлас нативной крови».

ISBN 978-5-88149-417-9

© Анисимова О.О., Морылева О.Н., 2010

Содержание

Список сокращений

Введение

Кровь – это уникальная субстанция нашего организма. От ее состава и физико-химических свойств зависит здоровье человека. В свою очередь, состояние крови является отражением всех обменных процессов, протекающих в организме, функциональной активности его органов и систем и, конечно же, патологических нарушений в них.

Со времен изобретения Антонием Левенгуком микроскопа, в изучении свойств крови наука прошла большой путь развития. За этот период создано колоссальное количество методов исследования этой важнейшей жидкой среды организма. Различные типы микроскопии, окраски препаратов, цитохимические и радиоизотопные методы, ИФА, ПЦР – это лишь очень неполный перечень существующих на сегодняшний день способов ее изучения. Но наиболее часто в клинической лабораторной практике для исследования крови используется микроскопия окрашенного мазка. Для этого мазок крови предварительно высушивается, фиксируется и окрашивается, а затем производится подсчёт форменных элементов и описывается морфология клеток. Нативную или живую кровь (без фиксации и окраски) микроскопируют достаточно редко. А между тем исследование «живой» капли – самый простой, информативный и минимально затратный метод исследования крови, который известен давно и широко использовался еще в прошлые века. В силу различных обстоятельств, на определенном этапе медицинская практика отошла от повсеместного использования данного метода. Но, как говорится, «все новое – это хорошо забытое старое».

И вот сегодня, в эру компьютеров и цифровых технологий, внимание к методу исследования нативной крови вновь возрастает и приобретает все большую популярность. Микроскоп удалось соединить с цифровой видеокамерой, телевизором и компьютером, что увеличило его разрешающую способность и дало возможность визуализировать на экране объекты крови, трудно различимые в обычный световой микроскоп, и, что очень важно, сохранять изображения для дальнейшей работы. Это позволило не только просматривать клеточные элементы крови, но и оценивать их динамические функциональные характеристики, выявлять биологические контаминанты в плазме, а также производить демонстрацию исследования пациенту. Последнее обстоятельство очень важно, поскольку включение пациента в диагностический процесс и получение им возможности оценки собственного состояния имеет огромное значение для привлечения его к эффективному сотрудничеству с врачом в вопросах восстановления его собственного здоровья.

В тоже время существуют определенные сложности с адаптацией исследования нативной крови к требованиям стандартизации и контроля качества по системе ФСФОК. В практическом же использовании метода возникает ряд вопросов по идентификации визуализируемых объектов вследствие недостаточного количества научно обоснованных данных по интерпретации результатов. Данные методические указания, опирающиеся на фундаментальную теоретическую базу и обширный исследовательский материал[1], в определенной мере восполнят существующий пробел и помогут упорядочить работу.

Вопросы терминологии

Метод исследования нативной крови под микроскопом не является новым в полном смысле этого слова. Обычная световая микроскопия, применяемая в лабораторной практике сегодня, максимально позволяет увеличивать просматриваемые объекты не более чем в 1500 раз. Этого достаточно для просмотра структуры окрашенных препаратов, но не дает возможности оценки динамических процессов в крови. Современная техника позволила модернизировать световую микроскопию и получить значительно больше информации о визуализируемых объектах. Но суть метода от этого не поменялась. Тем не менее целый ряд практикующих сегодня врачей называет это исследование по-разному: «темнопольник», функциональное гемосканирование и т.д. Эти формулировки ошибочны и затрудняют лицензирование деятельности.

Поэтому обращаем внимание специалистов на тот факт, что в приказах Министерства здравоохранения и социального развития РФ данный метод прописан и значится как микроскопия нативной крови, что полностью согласуется с общепринятой в лабораторной диагностике терминологией и отражает суть данного исследования. Таким образом, исследование под микроскопом капли интактной капиллярной крови в настоящих методических указаниях будет обозначаться в соответствии с официально принятой терминологией, как микроскопия нативной крови или МНК.

Общие вопросы

Метод микроскопии нативной крови подразумевает исследование образца крови сразу после взятия в течение не более 10-15 минут, после чего в крови происходят необратимые изменения. Капельку крови под покровным стеклом изучают сначала обзорно при малом увеличении, затем анализируют морфологию клеток и содержимое плазмы под иммерсией при максимальном увеличении. Важным отличием данного метода от обычных анализов является проведение исследования образца крови без какой-либо его предварительной обработки и в присутствии пациента. Пациент имеет уникальную возможность видеть свои клетки и в процессе исследования получать важнейшую для него информацию.

Перечень необходимого оборудования:

— световой микроскоп с увеличением в 1000-1500 раз с тринокуляром;

— конденсор для темнопольной микроскопии (необходимой опцией не является, т.е. его наличие для работы необязательно);

— адаптированная к микроскопу видеокамера (цифровая или аналоговая) с видеотюнером и S-video-выходом;

— устройство приёма и обработки изображений (компьютер или ноутбук – для приёма и сохранения фотоснимков и видеоизображений и/или телевизор для воспроизведения картинки на экране);

— пакет программного обеспечения.

Цель метода — экспресс-оценка общего состояния организма, включающая:

• определение неколичественных уровней насыщения его кислородом, водой и нутриентами (норма, снижение);
• анализ морфологических характеристик эритроцитов (формы, размеров, интенсивности окраски), по которым можно судить о наличии анемий и некоторых соматических заболеваний;
• оценка состояния лейкоцитов, а по их функциональной активности всей иммунной системы;
• оценка состояния свертывающей системы (склонность к тромбообразованию и прогноз связанных с этим осложнений);
• исследование чистоты плазмы на наличие биологических объектов (бактерий, грибов, других микроорганизмов без их идентификации);
• определение косвенных признаков воспалительных процессов, в т.ч. скрытых;
• определение маркеров сердечно-сосудистых заболеваний;
• признаки интоксикационного синдрома;
• контроль за динамикой восстановительных мероприятий;
• оценка функциональных резервов организма (адаптационных резервов и возможностей к самовосстановлению);
• мотивация пациента на самовосстановление и здоровый образ жизни.

Методика приготовления препарата

Кровь для исследования берут капиллярную, полученную обычным способом, из безымянного или среднего пальца пациента. Капля крови помещается на идеальное по чистоте, обезжиренное стекло и накрывается покровным стеклом, также тщательно обработанным.

Недопустимо использовать стекла сразу из упаковки без обработки и обезжиривания, а также предварительного визуального контроля на микроскопе при 400-кратном увеличении! Грязь великолепно видна на стекле при темнопольном микроскопировании (ТПМ).

Прокол пальца производится с использованием одноразовых скарификаторов, одноразовых спиртовых и стерильных салфеток с учетом правил санитарно-эпидемиологического режима при работе с кровью.

Капельку крови помещают на середину предметного стекла. Обращаем ваше внимание на то, что первые 1-2 капли нужно снять (их можно расположить на стекле сбоку, поскольку они для исследования не используются). Далее необходимо аккуратно накрыть основную каплю крови покровным стеклом таким образом, чтобы кровь равномерно распределилась под стеклом монослоем. Это очень важный момент для качественного приготовления препарата и получения максимально объективных результатов исследования.

Данный образец помещают на предметный столик микроскопа и просматривают сначала на малом (объективы 4, 10), затем на большом увеличении (объективы 40, 60, 100).

Артефакты

В результате использования некачественно обработанных стёкол, нарушения правил взятия крови и приготовления препарата можно неправильно интерпретировать результаты исследования и сделать ошибочные заключения. Это тем более недопустимо, поскольку анализ проводится в присутствии пациента.

Врач, производящий диагностику, должен учитывать, что предметное стекло, взятое из упаковки, загрязнено (см. фото, Атлас нативной крови). На предметных стёклах, взятых из упаковки, можно наблюдать частички пыли, ворсинки, сколы, нити, слущенный эпителий, жир и т.д.

Предметные стекла для исследования необходимо предварительно эффективно обрабатывать. Для этого они первоначально промываются моющими средствами и тщательно ополаскиваются в проточной воде, после чего помещаются в смесь Никифорова (смесь этилового спирта и эфира). Смесь должна храниться в стеклянной емкости с хорошо притёртой крышкой. Вместо смеси Никифорова можно использовать специальные готовые растворы для обработки предметных стёкол.

Далее стекла натирают нетканными салфетками и перед исследованием тестируют под микроскопом (без иммерсионного масла!).

Аналогичным образом обрабатываются покровные стекла.

Таким образом, подготовка стёкол перед исследованием имеет колоссальное значение для максимально объективной и информативной диагностики.

Клетки крови

В периферической капиллярной крови в норме можно наблюдать три различных группы клеток: эритроциты, лейкоциты и тромбоциты.

Эритроциты

Эритроциты – самая многочисленная популяция клеток крови. Количество эритроцитов в крови в норме поддерживается на постоянном уровне и составляет 3,5–5,0х10¹² в одном литре.

Продолжительность жизни эритроцита человека в среднем 120 суток.

Наибольшее число эритроцитов имеет диаметр — 7,2–7,5 мкм, площадь поверхности — 140 мкм², объем – 90 мкм³. Такую большую поверхность клетка имеет благодаря своей дискоидной двояковогнутой форме, которая совместно с высокой пластичностью и деформабельностью мембраны позволяет эритроциту проходить через капилляры шириной 2–3 мкм, проникать в стенки синусоидов, возвращаясь к исходным параметрам.

Для описания эритроцитов в клинической лабораторной практике принята специальная терминология. Обозначим сейчас основные наиболее часто встречающиеся термины.

Анизоциты – эритроциты разного размера.

Анизоцитоз – состояние, при котором явно выражена вариация размеров эритроцитов.

Анизохромия – различная окраска эритроцитов.

Гиперхромия – интенсивная окраска эритроцитов, связанная с повышенным насыщением гемоглобином (микропрепарат: отсутствие или уменьшение центрального просветления у эритроцита).

Гипохромия – снижение плотности окраски эритроцитов (микропрепарат: увеличение размера центрального просветления и уменьшение интенсивности окраски эритроцита).

Дакриоциты (каплевидные эритроциты) – эритроциты в виде капли.

Микроциты – эритроциты диаметром менее 6,5 мкм.

Микроцитоз – состояние, при котором преобладают микроциты.

Макроциты – эритроциты диаметром более 8–9 мкм.

Макроцитоз – состояние, при котором преобладают макроциты.

Мегалоциты – эритроциты диаметром более 10–12 мкм.

Монетные столбики – агрегаты эритроцитов.

Нормоцит – двояковогнутый эритроцит нормального размера (7,0–7,8 мкм) с центральным просветлением.

Нормобласт – ядросодержащий эритроцит, клетка – предшественник ретикулоцита. В норме в периферической крови не встречается.

Акантоциты – эритроциты с многочисленными шипиками различной величины.

Мишеневидные эритроциты – клетки с центральным расположением гемоглобина в виде мишени.

Овалоциты – эритроциты овальной формы.

Ретикулоциты – молодые эритроциты без центрального просветления (диаметр 7,7–8,5 мкм), образуются после потери нормобластами ядер.

Сфероциты – эритроциты сферической формы без центрального просветления.

Стоматоциты – эритроциты, центральное просветление которых имеет вид полоски или рта. При стоматоцитарной трансформации также могут образоваться сферостоматоциты, но в отличие от сфероэхиноцитов они не имеют шипов.

Шизоциты – фрагменты разрушенных эритроцитов. При прохождении через узкие сосуды и бифуркации под давлением часть эритроцитов механически повреждается и теряет форму двояковогнутого диска. Фрагменты этих эритроцитов подвергаются гемолизу или утилизируются нейтрофилами.

Шлемовидные эритроциты – фрагменты разрушенных эритроцитов в форме шлема.

Эхиноцит – эритроцит с шипами одинакового размера, расположенными равномерно по поверхности клетки. Выделяют эхиноциты трех стадий трансформации.

Наиболее часто встречающиеся ошибки в описании и интерпретации

1. Исследование капли в повреждённой части. Чтобы избежать ошибок, нужно анализировать образец в центральной части, так как при растекании по сухому стеклу максимально повреждаются клетки наружного слоя. По периметру препарата практически все эритроциты превращаются в эхиноциты, либо образуют густые плотные скопления деформированных клеток.
2. Изменение формы клеток при движении. При диагностике необходимо учесть один важный момент: когда мы накрываем каплю покровным стеклом, возникает спонтанное движение крови, что может неправильно интерпретироваться как движение эритроцитов. Самостоятельно в крови двигаться могут только лейкоциты. Эритроциты и тромбоциты передвигаются исключительно с током крови. Эти клетки не имеют способности к самостоятельному передвижению.Учитывая наличие большого количества рецепторов и антигенных детерминант на поверхности эритроцита, представляется разумным понимать возможность сцепления клетки с поверхностью стекла и изменения ее формы.
3. Выросты на клетках. В ряде научных работ показана способность клеток образовывать отростки на мембране – цитоплазматические выросты. Функция данных структур у эритроцита пока не очень понятна, но доказано, что эти образования не имеют ничего общего со жгутиками простейших.
4. Монослой. Важным моментом в приготовлении препарата является помещение капли крови под покровное стекло. Последнее должно равномерно накрыть каплю и распределить клетки монослоем. Если покровное стекло не прилегает равномерно к капле, клетки крови не распределяются в монослой, что делает невозможным диагностику.
5. Раздавливание капли. Если покровное стекло сильно прижать, клетки раздавливаются, эритроциты теряют форму двояковогнутого диска, сплющиваются, приобретают вид «теней».
6. Попадание в кровь посторонних веществ. Эритроциты будут выглядеть поврежденными, если в кровь, например, попал спирт при обработке пальца (кожу пальца не высушили).

Лейкоциты

В периферической крови встречаются три вида клеток, объединённых общим термином. Дифференцировка лейкоцитов происходит в костном мозге. Процесс выхода лейкоцитов из костного мозга высокоселективен. В норме в кровоток поступают только зрелые клетки. Это гранулоциты – клетки, содержащие гранулы, и агранулоциты – моноциты и лимфоциты. Каждый вид клеток специализирован на выполнение присущих только им задач.

Гранулоциты

По структуре гранул выделяют три группы клеток:

1. Нейтрофилы

2. Эозинофилы

3. Базофилы

Нейтрофилы составляют 60–70% общего числа лейкоцитов. Нейтрофилы рассматриваются как первая линия защиты организма. Основная функция этих клеток – участие в борьбе с микроорганизмами.

В зависимости от степени зрелости и строения ядра выделяют палочкоядерные и сегментоядерные нейтрофилы.

Палочкоядерные нейтрофилы имеют диаметр 10–18 мкм. Во время движения могут вытягиваться до весьма значительных размеров. Ядро клеток выглядит, как длинная изогнутая палочка без перемычек.

Сегментоядерные нейтрофилы имеют диаметр 10–16 мкм. Их ядро состоит из 2–5 сегментов и расположено центрально. Иногда из-за перегиба ядра перемычка между сегментами бывает не видна. Такую клетку принято относить к сегментоядерной.

Неактивные нейтрофилы имеют округлую форму, малоподвижны. Если размер нейтрофила равен или меньше размера эритроцита, можно говорить о снижении иммунитета.

Эозинофилы составляют 0,5–5% всех лейкоцитов в крови. По морфологии ядра выделяют палочкоядерные и сегментоядерные эозинофилы (аналогично нейтрофилам). Характерная особенность данных клеток – специфическая зернистость цитоплазмы. Гранулы эозинофилов ярче и крупнее, чем у нейтрофилов. Гранулы эозинофилов содержат главный щелочной (противопаразитарный) белок и значительное количество ферментов. Обладая слабой фагоцитарной активностью, эозинофилы вызывают внеклеточный цитолиз и участвуют в противогельминтном иммунитете. Объектом фагоцитоза могут быть бактерии, грибы, продукты распада тканей, иммунные комплексы. Важной функцией эозинофилов является и участие их в аллергических реакциях.

Базофилы составляют всего 0,5% от общего числа лейкоцитов. Это достаточно редко встречающаяся клетка. Базофилы подвижны, способны к фагоцитозу. В гранулах клеток содержатся гистамин, лейкотриены, тромбоксаны, ферменты и другие биологически активные вещества, поддерживающие реакции воспаления. Отличить базофил от эозинофила в нативной крови можно по меньшим размерам и более конденсированному ядру. Гранулы базофила крупнее, чем у нейтрофила, но мельче и нежнее, чем у эозинофила.

Как уже отмечалось, основная функция гранулоцитов – фагоцитоз, поэтому все они обладают способностью к передвижению, что и наблюдается в нативном препарате.

В норме в поле зрения (могут быть не в каждом) встречаются единичные гранулоциты. Они в 2–3 раза крупнее эритроцитов, подвижны. При угнетении иммунитета клетки становятся мельче, практически соотносимыми с размерами эритроцитов и малоподвижными.

В процессе развития воспалительной реакции происходит мобилизация костномозговых и циркулирующих лейкоцитов, развивается лейкоцитоз, что можно наблюдать в капле нативной крови.

Морфологические аномалии нейтрофилов:

• гиперсегментация ядер – наличие в ядре более 5 сегментов;
• кариорексис – распад ядра на мелкие части;
• кариолиз – частичное растворение ядра (размытые контуры);
• вакуолизация цитоплазмы и ядра;
• цитолиз клетки – ядро теряет свою структуру, цитоплазма размыта;
• клазматоз – фрагментация ядра или цитоплазмы;
• токсическая зернистость нейтрофилов;
• асегментация ядер гранулоцитов (пельгеровская аномалия).

Данные морфологические аномалии необходимо дифференцировать с артефактами, полученными при приготовлении препарата.

Агранулоциты

Моноциты

В периферической крови моноциты составляют от 1 до 10% всех лейкоцитов. Моноцит – это крупная клетка диаметром 12–18 мкм. Ядро различной формы: от бобовидной до сегментированной. Цитоплазма содержит многочисленные пылевидные гранулы, иногда можно наблюдать вакуоли и фагоцитированные частицы.

Моноциты обладают хорошей адгезивной способностью, легко прилипают к стеклу и пластику, поэтому на препарате они выглядят распластанными, фагоцитирующими клетками.

Лимфоциты

В крови лимфоциты составляют 20–35% всех лейкоцитов.

Популяция лимфоцитов чрезвычайно гетерогенна. Она включает три типа зрелых Т-лимфоцитов и три типа зрелых В-лимфоцитов, имеющих различные функциональные характеристики. Помимо этого, обнаружена популяция клеток, не несущая маркеров ни Т-, ни В-клеток. Это так называемые нулевые лимфоциты или естественные киллеры (NK). Нормальные размеры лимфоцитов варьируют от 4,5–6 мкм до 10–12 мкм.

Общими анатомо-морфологическими признаками для всех клеток лимфоидного ряда являются:

— ядро крупное, округлое или овальное;

— ядро расположено в центре или эксцентрично;

— цитоплазма прозрачная;

— зернистость всегда носит гранулярный характер.

По размеру цитоплазмы различают широкоплазменные, среднеплазменные и узкоплазменные (большие, средние и малые) лимфоциты.

Тромбоциты

Тромбоциты образуются при отшнуровке фрагментов цитоплазмы от гигантской клетки мегакариоцита и выполняют роль ключевого фактора гемостаза. Тромбоцит содержит набор органелл, которые обеспечивают жизненный цикл клетки.

Зрелые тромбоциты – это безъядерные клетки, имеющие круглую, овальную или звёздчатую форму.

В целом популяция тромбоцитов неоднородна. Микроформы тромбоцитов имеют диаметр менее 1,5 мкм, макроформы могут достигать 5 мкм и мегалоформы — 6–10 мкм. Активные (возбуждённые) тромбоциты имеют звёздчатую форму с нитевидными отростками-псевдоподиями.

Функции тромбоцитов определяются их способностью к адгезии, агрегации, транспорту различных веществ в крови, дегрануляции, ретракции кровяного сгустка и т.д. При изучении тромбоцитов, показано, что во время их физиологической активности в течение 1–2 минут большинство из них теряют дискоидную форму и распластываются на поверхности стекла, образуя псевдоподии. При МНК тромбоциты часто видны в виде звёздчатых распластанных клеток.

Склонность к повышенной агрегации видна в виде скоплений клеток различного размера. Стимуляторами агрегации тромбоцитов являются: АДФ, адреналин, норадреналин, тромбин, серотонин, фибриноген и др.

Неклеточные структуры крови

Плазма и ее компоненты

Соотношение объёмов клеточных элементов и плазмы составляет примерно 1:1. В физиологической системе крови плазма (жидкая фаза, суспензионная среда) выступает как консервативный, наиболее стабильный компонент, препятствующий патологическим изменениям рН. Диапазон изменений рН крови составляет всего 0,1 единицы, а значения 7,35–7,45 поддерживаются мощнейшей буферной системой крови. Поэтому кровь – это всегда слабощелочная среда и кислой не бывает (только при тяжёлой патологии, но это состояния, требующие реанимационных мероприятий).

Функции плазмы настолько разнообразны и настолько жизненно важны, что можно сказать: «Плазма есть сама жизнь».

При исследовании нативной крови нормальная плазма имеет вид прозрачной жидкости слегка голубоватого цвета.

Поскольку все вещества в плазме находятся в растворённом состоянии, они имеют чрезвычайно мелкие размеры. Поэтому увидеть их посредством светового микроскопа не представляется возможным.

При микроскопии хорошо визуализируются крупные полимеризованные нити фибрина и хиломикроны.

Фибриноген и фибрин

Фибриноген – белок острой фазы воспаления и один из основных факторов свёртывания крови. Синтез фибриногена происходит в печени.

При микроскопическом исследовании нативной крови можно видеть продукт полимеризации фибриногена – фибрин.

Механизм образования фибрина in vivo состоит из трех этапов:

1. Под влиянием тромбина от фибриногена отщепляются фибринопептиды А и В, в результате чего образуются мономеры фибрина. Эта реакция происходит при обязательном участии протеолитических ферментов.

2. При участии кальция происходит агрегация и полимеризация мономеров. Образуется растворимый фибрин.

3. От растворимого фибрина с помощью ферментов отщепляется сиаловая кислота, что ведет к образованию нерастворимого фибрина и формированию сгустка.

In vitro процесс протекает несколько иначе. Через некоторое время после взятия крови запускается процесс ее свёртывания и на препарате появляются нити фибрина в виде нежных темных полос на фоне прозрачной плазмы. Иногда нити фибрина настолько тонки, что практически неразличимы в микроскоп, что, конечно, не означает их полного отсутствия.

Через 10–15 минут при участии тромбоцитов начинается ретракция кровяного сгустка и процесс фибринолиза.

При заболеваниях фибрин выпадает очень быстро и нити его значительно грубее. Это зависит от исходного содержания в плазме фибриногена. А его уровень, как известно, повышается при целом ряде заболеваний.

Нарушения в питании, наследственные факторы, определённые патологические состояния и заболевания (сахарный диабет, гиперхолестеринемия), курение, алкоголь, неблагоприятные социальные условия и стрессы, токсические влияния и целый ряд фармакологических средств, а также возраст влияют на концентрацию фибриногена в крови. По данным зарубежных исследований, вышеназванные неблагоприятные воздействия приводят к повышению уровня фибриногена, в то время как при возвращении к здоровому образу жизни его количество достоверно снижается.

Антиоксиданты (природные витамины А, С, Е и готовые формы атиоксидантов, таких как микрогидрин, фикотен, фитоси), свежие фрукты и овощи, а также достаточная физическая нагрузка также выраженно способствуют снижению уровня фибриногена и фибрина (см. фото, Атлас нативной крови).

Учитывая всё изложенное, целесообразно регулярно и в течение длительного времени проводить повторные исследования нативной крови и оценивать динамику свёртывающей системы по указанным визуальным признакам. Особенно это актуально для пациентов, относящихся к группам риска развития сердечно-сосудистых заболеваний.

Хиломикроны

Хиломикроны (ХМ) – это первый транспортер поступающих с пищей липидов (прежде всего триглицеридов (ТГ)) на их пути через лимфу в кровь. Хиломикроны образуются преимущественно в энтероцитах кишечника. Их функция: перенос экзогенного жира из кишечника в ткани (преимущественно в жировую ткань). Размеры хиломикрона достаточно велики (сравнимы с размерами эритроцитов), поэтому он не может пройти через поры, имеющиеся в стенках кровеносных капилляров, путем экзоцитоза. Путем экзоцитоза хиломикроны поступают в лимфу и с ее током попадают в большой круг кровообращения. После употребления в пищу жира в крови наблюдается повышенное содержание хиломикронов.

Иногда в крови встречаются такие аналиты (компоненты плазмы), происхождение и структура которых пока не совсем ясна. Они являются, в частности, одним из множества сюрпризов, которые уже преподнёс исследователям метод МНК. Поэтому очень важно продолжать научный поиск в данной области.

Микроорганизмы

(апатогенные и патогенные)

Пожалуй, одним из самых интересных результатов исследований с помощью метода микроскопии нативной крови стало обнаружение в ней различных форм жизни. Большинство врачей до сих пор твёрдо убеждены, что кровь – стерильна! Это — миф, разрушить который оказалось очень сложной задачей. В книге «Атлас нативной крови» представлены достоверные доказательства того, что кровь – среда обитания не только клеток, но и огромного количества комменсалов, различных микроорганизмов, в т.ч. и паразитарных форм.

Справедливости ради необходимо отметить, что в естественных науках (биологии, микробиологии и др.) никогда и не постулировалось положение о стерильности крови, исходя из многочисленных наблюдений и того факта, что кровь – это основная транспортная система организма. Чтобы убедиться в этом, достаточно просмотреть научные труды не только периода 20 столетия, но даже датируемые 19 веком. Современные исследования также полностью подтверждают факт наличия форм жизни в крови.

Разрешающая способность современной аппаратуры позволяет нам при проведении МНК визуализировать достаточно большое количество живых (движущихся) микроорганизмов в крови.

Возникают следующие вопросы: может быть нарушены правила асептики и антисептики при проведении анализа, или, возможно, вся эта «живность» попадает из воздуха?

В большинстве случаев это не так! Данные отечественной и зарубежной науки, а также собственные исследования показали, что визуализируемые в крови микроорганизмы, попали на предметное стекло из кровеносного русла. Кровь же является для них средой обитания либо транслокации. И это вполне логично, мы живем в природе, а человек – это открытая система.

Сегодня уже всем известен факт присутствия в организме человека достаточно большого количества самых разнообразных микроорганизмов, которые образуют его биоценоз. При этом следует помнить, что даже в норме, кроме облигатной микрофлоры, у человека в его внутренней среде присутствуют также условно-патогенные и транзиторные микроорганизмы. Основная их среда обитания у человека – это ЖКТ, вагина, уретра. Но при определённых условиях микрофлора может заселять и несвойственные ей ниши, вызывая различные заболевания, такие как пневмонии, бронхиты, тонзиллиты, циститы и др. Расселение ее по организму происходит, в основном, гематогенным путем. По данным микробиологов, 70 % микроорганизмов – гемоформы, то есть пути их транслокации по организму проходят через кровь.

Считается, что приблизительно 40 % всей патологии человека прямо или косвенно связано с пагубной деятельностью патогенной и транзиторной микрофлоры. Заболевание может вызывать также и факультативная флора, например при увеличении количества микробных тел либо снижении общего и/или местного иммунитета.

Уникальная способность бактерий приспосабливаться и выживать в экстремальных условиях, длительно персистировать в организме, не вызывая клинических проявлений, и склонность к полиморфизму позволяет им благополучно выживать даже после антибиотикотерапии.

Бактерии могут не находиться в крови постоянно, а лишь транзиторно проходить через нее. В этом случае их наличие в крови не всегда является признаком патологии. О том, что микроорганизмы, визуализируемые в препарате нативной крови, могут быть причиной заболевания, можно думать в случае увеличения их количества, появлении ассоциаций (разнообразия форм), а также при наличии соответствующей клинической картины. Кроме того, существует целый ряд паразитарных форм, обнаружение которых в крови всегда свидетельствует о патологическом процессе (возможно, латентно протекающем), например, яйца и личинки гельминтов, грибы, определенные виды простейших и др.

Часть этих форм обитает в крови, другая попадает туда транзиторно, перемещаясь по организму, реализуя предназначенный природой жизненный цикл.

Бактерии

В настоящее время наиболее распространённой классификацией, используемой большинством микробиологов и бактериологов, является классификация Берджи. Согласно этой классификации, прокариоты (бактерии) делятся на два домена «Bacteria» и «Archaea».

При нативной микроскопии мы не можем идентифицировать вид бактерий, а потому следует говорить лишь об их форме и размере.

Формы бактерий наблюдаются самые разнообразные: сферические или кокки, диплококки, палочковидные, извитые, спиралевидные и т.д.; размер их может варьировать от 0,15 мкм (микоплазмы) до 8 мкм (палочковидные) и до 50 мкм у актиномицетов. Стафилококк – грамположительный круглый кокк размером 1 мкм, стрептококк – кокк неправильной формы, неподвижен, размер от 0,5 до 2 мкм.

Можно абсолютно точно утверждать, что бактерии попадают в диапазон разрешающей способности светового микроскопа, а потому их можно наблюдать при исследовании нативной крови.

Бактерии не находятся в крови постоянно, они лишь транзиторно проходят через кровь, и их наличие в препарате не всегда является признаком патологии.

К домену бактерий современными классификаторами отнесены и не совсем обычные микроорганизмы. Речь идет о микоплазме и уреоплазме. У этих бактерий отсутствует клеточная стенка. Другой их особенностью является то, что они длительно могут персистировать в организме, являясь его условно-патогенной флорой, и не провоцирвать симптоматики. Но при определённых условиях, эти микроорганизмы способны вызывать как острые, так и хронические вялотекущие со стёртой клиникой заболевания, например при снижении иммунитета либо при резком увеличении микробных тел. В этих случаях нативная микроскопия позволяет обнаруживать полиморфные колонии бактерий (микроорганизм слишком мелкий) и большое их количество, особенно после проведения функциональной пробы с водной нагрузкой. В то время как лабораторными методами диагностики эти возбудители не всегда выявляются, так как являются тканевыми (клеточными) паразитами.

Вирусы

Мельчайшие микробы, не имеющие клеточного строения, содержат только ДНК или РНК. Морфологию вирусов изучают с помощью электронного микроскопа, так как размер вирусов чрезвычайно мал (от 18 до 400 нм). Световые микроскопы предназначены для изучения объектов не менее 0,2 мкм, поэтому крупные скопления вирусов, так называемые вирусные тельца, мы можем видеть, но как их идентифицировать от гранул и вакуолей лейкоцитов, нам пока не понятно, учитывая, что вирус – это облигатный внутриклеточный паразит. В то же время, по данным ряда исследований, вирусные тельца хорошо визуализируются в эритроците.

Неклеточные формы включают еще более мелкие частицы, такие как прионы (белковые инфекционные частицы, вызывающие прионные болезни со смертельным исходом) и вироиды (небольшие молекулы кольцевой суперспирализованной РНК, вызывают болезни растений). Данные объекты в световой микроскоп не видны.

Простейшие

Простейшие – эукариотические одноклеточные микроорганизмы, содержат ядро с ядрышком и цитоплазму с органеллами. Размеры простейших от 2 до100 мкм.

Простейшие имеют: органы движения (жгутики, реснички, псевдоподии), питания (пищеварительные вакуоли) и выделения (сократительные вакуоли). Подцарство простейших включает 7 типов, из которых 4 значимы для человека и чаще всего вызывают заболевания. Основные и наиболее распространённые возбудители болезней среди простейших: трихомонада, лейшмания, трипаносома, дизентерийная амеба, токсоплазма, лямблии, малярийный плазмодий и балантидий.

Нахождение в крови лейшманий, трипаносом и малярийного плазмодия вопросов не вызывает, поскольку при попадании в организм они либо паразитируют в клетках крови, либо используют кровь как транспортную систему. Наличие данных паразитов всегда сопровождается соответствующей клиникой.

Токсоплазма тоже проходит стадию развития в крови, но часто встречается скрытое носительство при отсутствии клинических проявлений.

Спорным до сих пор является присутствие в крови лямблий и трихомонад, поскольку непонятен механизм их выживания в несвойственной для них среде. В литературе также нет достоверных данных об обнаружении и идентификации этих простейших в периферической крови.

Грибы

Грибы – одноклеточные или многоклеточные гетеротрофные нефотосинтезирующие эукариотические микроорганизмы. Царство грибов насчитывает более 100 000 видов. Среди них встречаются сапрофиты, паразиты и факультативные паразиты растений, животных и человека. Наибольшее значение для медицины имеют несовершенные грибы (около 30 тысяч видов).

К несовершенным грибам, в частности, относятся формы, вызывающие грибковые заболевания ног и стригущий лишай.

В клинической практике известны грибы, вызывающие всевозможные микозы (кератомикозы, дерматомикозы и др.), а также возбудители оппортунистических микозов: Candida, Mucor, Aspergillus, Penicillium, Fusarium.

Форма, размеры и мицелий специфичны для каждого вида.

К самым известным «обитателям» человека безусловно относится Candida, которая является частью условно-патогенной и транзиторной микрофлоры млекопитающих и человека. На фоне ослабленного иммунитета, при попадании в ткани данная эндогенная флора вызывает кандидозы различной локализации: пневмонии, бронхиты, язвенные процессы в ЖКТ, циститы и др.

Поскольку грибы являются клетками размером от 0,5 до 10–15 мкм, а гифы и мицелий измеряются десятками микрометров, они прекрасно видны в световой микроскоп. В крови Candida визуализируется в виде белых округлых или овальных образований. Гораздо сложнее их идентифицировать, учитывая колоссальное разнообразие форм. Только род Candida насчитывает около 200 видов несовершенных дрожжеподобных и совершенных дрожжевых грибов.

Достаточно часто в крови можно встретить микроорганизмы дрожжевых и диморфных грибов в стадии почкования, характерным признаком которых является плотная, четко очерченная поверхность.

Чтобы различать клетки грибов от клеток крови, нужно учитывать, что грибы кроме мембраны имеют многослойную ригидную клеточную стенку.

Этот факт существенно помогает отличить, например, деформированный эритроцит от клетки гриба.

Гельминты

Гельминты – многоклеточные паразитические черви. Термин «гельминтозы» был введен еще Гиппократом. Сегодня известно более 100 тысяч видов паразитических червей. У человека описано их более 250 видов. Проблема гельминтозов стала чрезвычайно актуальна в настоящее время. В результате развития туризма и увеличения миграции населения, всё чаще в Европе, РФ и странах СНГ стали встречаться экзотические виды паразитов и редких гельминтозов, диагностика которых абсолютно не разработана.

По форме тела и циклам развития выделяют три различных группы гельминтов: нематоды, трематоды и цестоды.

Не углубляясь в классификацию, описание морфологии и жизненного цикла гельминтов, приведём лишь их размеры и возможность обнаружения в капиллярной периферической крови при микроскопии.

По современным научным данным (научно-обоснованным и официально подтверждённым), в периферической крови могут быть обнаружены следующие виды гельминтов в личиночной их стадии: анкилостома, некатор, аскарида, токсокара, бругия, вухерерия, лоа лоа, стронгилоид, трихинелла, шистосома.

Размеры взрослых особей, их личинок и яиц весьма значительны. Ниже представлены некоторые из них, приведённые в официальных документах (МУК 2.1.7.730-99 (По состоянию на 18 октября 2006 года) «Гигиеническая оценка качества почвы населённых пунктов», МУК 13-4-2/1751 «Возбудители гельминтозоонозов в пресноводных рыбах» от 04.10.99):

• Шистосома (Schistosoma mansoni) – 10–16 х 0,17–1,2 мм (самые крупные яйца среди гельминтов 140–150 мкм).
• Описторхи (Opisthorchis felineus) – 5,4–10,2 х 0,8–1,9 мм (яйца 30–40 мкм).
• Фасциола гепатика (Fasciola hepatica) – 20–30 х 8–13 мм (самые крупные яйца среди гельминтов 130–150 мкм).
• Вухерерия (Wuchereria bancrofti) – 80–100 х 0,24–0,3 мм, микрофилярия – 127–320 х 7–10 мкм.
• Анкилостома (Ancylostoma duodenale) – 10–13 х 0,4–0,6 мм (яйца 60 х 40 мкм, рабдитовидная личинка 250 х 16 мкм, филяриевидная – 660 х 17мкм).
• Стронгилоид (Strongyloides stercoralis) – 2,2 х 0,03–0,07 мм.
• Размеры бычьего и свиного цепня измеряются метрами!
• Личинки аскариды во время миграции по кровяному руслу дважды линяют и увеличиваются в размере с 0,19–0,25 до 1,5–2,2 мм в длину. Размер оплодотворённых яиц составляет 50–70 х 40–50 мкм, а неоплодотворённых — 50–100 х 40–60 мкм.
• Метацеркарии трематод Opisthorchis felineus 0,28–0,38 х 0,18–0,28 мм, Еchinochasmus perfoliatus 0,080–0,11 х 0,079–0,098 мм.

Обращаем ваше внимание на то, что указаны величины личинок, паразитирующих в рыбе. Продолжая свой жизненный цикл в организме человека, они еще больше увеличиваются в размерах.

Размеры гельминтов и их личинки значительно превышают величину не только клеток крови, но и капиллярного русла. Поэтому возможность встретить их при микроскопии периферической капиллярной крови – скорее исключение, чем правило.

Другие биологические формы

При микроскопии нативной крови достаточно часто обнаруживаются объекты, идентифицировать которые пока не представляется возможным. Не исключено (особенно при наличии определенной клинической картины), что визуализируемые в крови биологические контаминанты относятся к паразитарным формам жизни. Но однозначно это утверждать не представляется возможным. Сложность интерпретации объясняется отсутствием исследований по идентификации данных объектов. Тем не менее однозначно понятно, исходя из размеров (всего одна клетка), большинство из них – это не гельминты, поскольку все гельминты многоклеточные! Среди известных одноклеточных микроорганизмов большинство подобных форм не наблюдаются. От эритроцитов они отличаются подвижностью и иной структурой клеточного строения. Для прояснения этих вопросов необходимы глубокие серьезные исследования. Но на сегодняшний день именно эти объекты активно обсуждаются в среде практикующих врачей, причем нередко беспредметно создают почву для необоснованных домыслов.

Приложение № 1

МИКРОСКОПИЯ НАТИВНОЙ КРОВИ

ЭТАПЫ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

I. Методика приготовления препарата

1. Подготовка предметных и покровных стекол (стекла готовятся до исследования).

1.1. Замачивание стекол в специальном растворе (этиловый спирт 96° + эфир для наркоза =1:1) с целью обезжиривания (не менее 1 часа).

1.2. Тщательная натирка стекол нетканой салфеткой.

1.3. Предварительный контрольный просмотр стекол перед исследованием при 400-кратном увеличении на предмет наличия возможных артефактов.

2. Взятие крови.

2.1. Кровь для исследования берут капиллярную из безымянного или среднего пальца.

2.2. Палец тщательно протирается спиртовой салфеткой. Затем высушивается стерильной сухой марлевой салфеткой.

2.3. Прокол пальца производят с использованием одноразового скарификатора.

2.4. Каплю крови помещают на середину покровного стекла и аккуратно (без усилий – во избежание раздавливания клеток крови и появления артефактов) накрывают покровным стеклом, также тщательно обработанным. Кровь под стеклом должна распределиться равномерно монослоем, что очень важно для объективности результатов. Примечание: первые 1–2 капли крови помещаются на предметное стекло в боковой его части.

2.5. Полученный препарат крови помещают на предметный столик микроскопа и просматривают сначала на малом (объективы: 4, 10), а затем на большом (объективы: 40, 100) увеличении.

II. Микроскопия крови

Увеличение и разрешающая способность светового микроскопа позволяют визуализировать в крови в основном только нижеперечисленные объекты:

1. Клетки крови

Эритроциты:

— нормальные дискоциты (6–8 мкм);

— анизоциты (микро- и макроформы 4–15 мкм);

— пойкилоциты (клетки с измененной формой);

— анизохромные (с различной окраской);

— юные и незрелые формы (ретикулоциты, нормобласты);

— эхиноциты, стоматоциты, шлемовидные эритроциты;

— гемолизированные эритроциты и другие формы деградации и старения эритроцитов;

— включения в эритроцитах (остатки ядра);

— агрегаты эритроцитов.

Лейкоциты:

— гранулоциты (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы);

— агранулоциты (моноциты, Т- и В-лимфоциты);

— плазматические клетки;

— юные и незрелые формы (в том числе бластные).

Тромбоциты (молодые и старые клетки) различного размера (до 5 -10 мкм) и их скопления.

2. Фибрин (в виде нитей и тяжей).

3. Хиломикроны (шарообразные опалесцирующие структуры светло-зеленого цвета размером до 5–8 мкм).

4. Бактерии разного размера и формы, подвижные и неподвижные (примечание: без видовой идентификации!).

5. Одноклеточные простейшие паразиты (малярийный плазмодий, пироплазма, токсоплазма, лейшмания, трепаносома, возможно – трихомонада), несовершенные грибы (в т. ч. диморфные), Candida, колонии микоплазмы или уреаплазмы.

6. Возможно обнаружение яиц глистов и миграционных личиночных стадий некоторых гельминтов (микрофилярий, аскарид, анкилостом, некатора, трихинелл и др.). Диагностика гельминтозов проводится с учетом их макроразмеров (значительно крупнее эритроцита, примерно от 100 и больше мкм)!!! Редчайшей диагностической находкой может быть обнаружение взрослого гельминта (очевидно, что это многоклеточное существо также будет макроразмеров).

Примечания:

1. Классифицирование гельминтов и других биологических объектов, визуализируемых в нативной крови, с целью определения их видовой спецификации проводиться не должно и в заключении врача не может быть отражено вследствие отсутствия соответствующей научно обоснованной доказательной базы по идентификации паразитарных форм. Биологические объекты в крови (за исключением бактериальной флоры) в заключении целесообразно называть патогенными микроорганизмами или паразитарными формами.
2. Достаточно часто в образце нативной крови визуализируется значительное количество артефактов вследствие некачественной обработки стекол, ошибок при заборе крови и неправильного приготовления препаратов.

III. Функциональная проба

При наличии показаний (выраженной агрегации эритроцитов, снижении физиологической активности лейкоцитов и др.) целесообразно проводить функциональную пробу, которая у взрослого человека включает:

• прием воды (от 200 до 500 мл; рекомендуемый объем воды определяется возрастом, состоянием здоровья человека и результатами микроскопии);
• прием нутрициологических продуктов по выбору и в сочетаниях: корал-майн, гидросел, микрогидрин, ферменты;
• через 20–40 минут – повторный забор крови и микроскопия образца;
• по динамике визуализируемых изменений производится оценка показателей адаптационных резервов организма.

Цель проведения функциональной пробы: оценка адаптационных резервов организма человека и индивидуальный подбор БАД к пище в качестве превентивной диетотерапии для профилактики возникновения заболевания либо предупреждения его прогрессирования.

Приложение № 2

Протокол заключения

Ф.И.О. пациента

Дата рождения

Пол М Ж

Ф.И.О. врача

Заключение по наличию изменений в крови и результатам пробы (характеристика адаптационных резервов организма (АРО)):

• АРО — удовлетворительные;
• АРО — умеренное отклонение показателей от нормы;
• АРО — выраженное отклонение показателей от нормы.

Превентивная диетотерапия

По результатам исследования в качестве корректоров рациона питания осуществляется индивидуальный подбор БАД к пище (…) с целью оптимизации физиологических функций организма и повышения адаптационных резервов.

Дата «____» ___________ 20___ г

Врач __________________

Протокол заключения

(сокращенный вариант)

Ф.И.О. пациента

Дата рождения

Пол М Ж

Ф.И.О. врача

Дата «____» _______________ 20___ г

Врач __________________

Приложение № 3

Программы диетической коррекции функционального состояния крови нутрициологическими продуктами[2]

Перечисленные в программах БАД к пище – это сбалансированные и качественные нутрициологические продукты, являющиеся источниками важных витаминов, минералов и пищевых растений, позволяющих улучшить функциональное состояние физиологических процессов, повысить адаптационные резервы организма, защитить его от вредных факторов экологии и некачественной пищи.

Приложение № 4

Краткое описание нутрициологических продуктов

Гидросел

Минеральный концентрат, улучшающий физико-химические свойства питьевой воды, тем самым способствующий ее биологической активации. Известно, что оптимизированная по свойствам вода лучше усваивается в организме и быстрее вступает в метаболические процессы.
Продукт рекомендуется для восстановления и оптимизации водно-электролитного баланса в организме человека.
Состав: очищенная вода, кремний, соли калия и магния.

Применение: употреблять по 10 капель на 1 стакан воды.

Дигистейбл

Натуральный продукт, включающий сбалансированный комплекс ферментов растительного и микробиологического происхождения. Энзимы обладают выраженной широтой воздействия на физиологические системы и функции организма: помогают лучше усваивать компоненты пищи, оказывают общеукрепляющее действие, повышают защитные силы. Протеолитические ферменты известны своей иммуномодулирующей, противовоспалительной, противоотечной активностью и связанным с этим вторичным обезболивающим эффектом. Они обеспечивают антиоксидантную защиту, снижают агрегацию форменных элементов крови, улучшают ее реологические свойства.
Состав: протеазы, амилаза, липаза, лактаза, целлюлаза, инвертаза, бромелайн, мальтдиастаза, альфа-галактозидаза, папаин.

Применение: взрослым по 1–2 капсуле 2–3 раза в день.

Корал-майн

Продукт представляет собой минеральную композицию из природного белого коралла. Измельченный коралл является источником важнейших для здоровья человека минералов – кальция, магния, калия, серы, кремния и многих других, благодаря которым происходит значительное улучшение физико-химических и вкусовых свойств воды, ее структурных характеристик. Серебро, входящее в состав продукта, обеспечивает доказанное дезинфицирующее воздействие. Вода, активированная порошком белого коралла, улучшает реологические свойства крови и функциональное состояние всего организма, увеличивая его адаптационные резервы и ускоряя процессы восстановления.
Состав: в 1 пакете-саше содержится измельченный порошок коралла, серебро и аскорбиновая кислота.

Применение: Корал-майн рекомендуется в качестве натурального кондиционера питьевой воды. Помещать в питьевую воду, из расчета 1 пакет-саше на 0,5–1,5 литра воды; употреблять от 1,5 до 2 л/сут.

Микрогидрин (микрогидрин плюс)

Микрогидрин – высокоактивный антиоксидант последнего поколения, обогащенный фитокомпозицией (микрогидрин плюс). Комплекс кластеров кремнезема, входящих в его состав и насыщенных гидрид-ионами водорода, определяют выраженную реакционную способность комплекса. Подобная технология уникальна не только мощными антирадикальными свойствами, но и тем, что в отличие от других антиоксидантов микрогидрин, отдавая электроны, сам не превращается в свободный радикал, а распадается на усвояемые и очень важные для организма вещества – кремний, калий, магний, водород, лимонную кислоту и др. Известно также, что лимонная кислота и кремний оказывают благотворное влияние на мочевыделительную систему: способствуют стабилизации мочевых коллоидов и предотвращают образование камней.
Продукт рекомендуется использовать для повышения общего тонуса организма, защиты от профессиональных вредностей и неблагоприятных экологических воздействий, при заболеваниях и состояниях, сопровождающихся повышением активности процессов образования свободных радикалов, воспалениях и интоксикациях.
Состав: кремний, калий, магний, витамин С, N-ацетил-L-цистеин, кверцетин, липоевая кислота, селен (аминокислотный хелат), экстракт молочного чертополоха.

Применение: взрослым и детям старше 14 лет принимать в качестве биологически активной добавки по 1–2 капсуле 1–3 раза в сутки.

Чеснок

Чеснок ценен как продукт питания, поскольку чрезвычайно богат биологически активными веществами, оказывающими широкий спектр воздействия на организм человека. В настоящее время уже открыт практически весь уникальный состав биологически активных компонентов чеснока.

Помимо аллицина, в чесноке содержится фитостерин, большое количество серусодержащих веществ, а также аскорбиновая кислота, витамины А, В1, В2, комплекс минералов, которые в своей совокупности обуславливают его широкую востребованность как ценного пищевого и лекарственного растительного средства. БАВ чеснока обладают значительным противоинфекционным действием (бактерицидным, противовирусным, фунгицидным, противоглистным), оказывают противоатеросклеротический и гипотензивный эффект, улучшают реологические свойства крови, повышают иммунитет и замедляют рост злокачественных клеток. Учитывая то, что для свежего чеснока характерна кратковременность биологического действия из-за быстрого разрушения его БАВ, современное производство предлагает технологии, прерывающие эти процессы. Стандартизированные чесночные нутрициологические продукты, к которым относится БАД «Чеснок» обладают всеми свойствами свежего чеснока.
Состав: эфирное масло чеснока, стандартизированное по БАВ.

Применение: в качестве биологически активной добавки принимать по 1 капсуле 2–3 раза в день.

Тру Лецитин

Высококачественный комплекс фосфолипидов, состоящий из холина, фосфатидов и инозитола. Фосфолипиды обладают широким спектром воздействия на физиологические функции организма. Они восстанавливают структуру печени и легких, регулируют образование желчи, предупреждают возникновение жирового гепатоза и развитие цирроза при злоупотреблении алкоголем, эффективны для профилактики атеросклероза, выводят излишки холестерина из тканей и сосудов, стабилизируют уровень триглицеридов в крови, способствуют снижению массы тела, используются всеми нервными клетками для синтеза нейротрансмиттеров (веществ, ответственных за передачу нервных импульсов). Лецитин необходим в рационе питания беременных и кормящих женщин, т.к. участвует в формировании и нормальном развитии мозга и нервной системы ребенка. Лецитин играет важную роль в иммунной защите, участвуя в выработке антител, стимулируя рост и активность иммуноцитов.
Состав: соевый лецитин холин (фосфолипиды и полиненасыщенные жирные кислоты).

Применение: в качестве биологически активной добавки по 1–2 капсуле 1–2 раза в день.

Сильвер-Макс

Коллоидное серебро – это современная альтернатива синтетическим антибиотикам, преимуществом которого является отсутствие побочных эффектов при использовании его в рекомендуемых дозах.
Молекулы серебра обладают широким противоинфекционным действием, препятствуют размножению бактерий, вирусов, грибков.
Сильвер-макс применяется в качестве источника серебра.
Состав: очищенное коллоидное серебро, деминерализованная вода. В 1 ч.л. содержится 50 мкг коллоидного серебра.

Применение: может использоваться как для внутреннего, так и для наружного применения; в качестве добавки к пище принимать по ч.л. 2–3 раза в день.

Про-волокно

Комплекс, содержащий целый спектр пищевых волокон, преимущественно растворимых, а также специально подобранных лекарственных растений и природных ингредиентов, которые необходимы для нормализации функций желудочно-кишечного тракта и обмена веществ в организме.

Пищевые волокна способствуют выведению токсических веществ из организма, регулируют уровень сахара в крови, снижают риск развития сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний, способствуют снижению массы тела, регулируют стул.

Состав: смесь волокон (целлюлоза, овсяные волокна, яблочный и цитрусовый пектин, гуммиарабик, семена льна, гуаровая камедь), фруктоолигосахариды, алоэ-гель, витамин А и др.

Применение: 2 ч.л. 1–2 раза в день.

Набор трав № 7

Комплексная биологически активная добавка, содержащая растительные ингредиенты, обладающие достаточно широким спектром противоинфекционной (бактерии, вирусы, грибки) и антигельминтной активности. Фитокомпоненты комплекса полезны для повышения общей неспецифической резистентности организма, обладают противовоспалительной активностью, улучшают заживление ран, способствуют пищеварению и нормализации стула.

Состав: листья черного ореха, чеснок, кора кассии, целлюлоза.

Применение: растворить 1–2 таблетки в стакане горячей воды, принимать как чай 2–3 раза в день.

Зелёное золото

Формула содержит растительный и витаминно-минеральный комплексы, компоненты которых известны своим отчетливо выраженным иммуномодулирующим действием. Доказано, что под их влиянием происходит активизация защитных сил организма, повышается умственная и физическая работоспособность, снижается активность воспалительных процессов, оптимизируются процессы образования энергии. Формула восполняет дефицит микронутриентов, имеющих важное значение для работы иммунной системы. В продукт входят микронутриенты и фитосредства, благотворно влияющие на кроветворение и улучшающие функциональное состояние форменных элементов крови.

Состав: витамин А, витамины группы В, магний, железо, хром, фосфор, женьшень тянь-шаньский, порошок плодов папайи, спирулина, цветочная пыльца.

Применение: принимать в качестве биологически активной добавки к пище по 6 таблеток в первой половине дня.

Коло-вада плюс

Комплексная программа нормализации функциональной активности кишечника, а также поэтапной детоксикации и оптимизации эндоэкологии организма.

Программа состоит из трех последовательных этапов: подготовительного, детоксикационного и восстановительного. В течение этого периода происходит прием фитосредств заданной направленности действия.

Система Коло-вада плюс рекомендована для восстановления функции ЖКТ и биллиарного тракта, улучшения обменных процессов, повышения иммунитета и общей неспецифической резистентности организма.

Программа рассчитана на 14 дней.

Состав: витамины, микроэлементы, пробиотики, растительные слабительные средства, пищеварительные и протеолитическое ферменты, травы с противоинфекционной и антигельминтной направленностью действия, пищевые волокна, неорганические адсорбенты.

Применение: по 1 пакетику 2 раза в день в течение 14 дней.

Фито — Си

Продукт является источником натурального витамина С и биофлавоноидов. Витамин С играет жизненно важную роль для здоровья человека, однако в организме витамин С не вырабатывается, поэтому должен ежедневно поступать с пищей и/или добавками к ней.

Фито-Си содержит в своем составе аскорбиновую кислоту (АК) в форме нейтральной соли – аскорбата. В таком виде АК меньше раздражает слизистые ЖКТ, лучше усваивается, медленнее выводится из организма. Входящие в продукт биофлавоноиды являются синергистами АК: улучшают усвоение и активирует ее действие. Усиливает формулу фитокомплекс, состоящий из растений, богатых натуральным витамином С.

Дополнительный прием витамина С необходим практически каждому жителю городов, особенно тем, кто связан с высокими интеллектуальными и физическими нагрузками, вредными условиями труда, для профилактики и ускорения выздоровления при заболеваниях. Особенно БАД показана людям с пониженным иммунитетом, проживающим в экологически неблагоприятных районах, а также курящим.

Состав: витамин С (нейтральная соль), цитрусовые биофлавоноиды, филлантус (индийский крыжовник), клюква.

Применение: в качестве добавки к пище по 1 капсуле в сутки.

Список литературы

О.О. Анисимова, О.Н. Морылева

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

МИКРОСКОПИЯ НАТИВНОЙ КРОВИ

Персональный сайт — Занятия «Мир под микроскопом» (ucoz.ru)

Пояснительная записка

Занятие кружка «Мир под микроскопом» 

Возраст: 8-15лет

Направленность: естественнонаучная

Тип занятия: комплексное применение знаний

Форма обучения: заочная (с применением информационно-коммуникативных технологий, в том числе с применением дистанционных образовательных технологий)

Занятие разработано: по Дополнительно общеобразовательной (общеразвивающая) программе «Мир под микроскопом» Составитель: канд. биол. наук, доцент Габдулинова Камиля Гапбасовна.

Основой занятия – Является просмотром видео лекций, презентации, самостоятельное выполнение заданий, обобщающее тестирование.

 Необходимые технические средства: выход в интернет, ноутбук. смартфон, микроскоп.

Методы и приемы: репродуктивные, интерактивные, частично-поисковые, исследовательские, наглядные, диалоговый.

 Деятельность обучающихся: индивидуальная

Технологии: ИКТ, личностно-ориентированная, здоровье сберегающая.

Основные принципы при проведении занятия:

не развлекательность, а занимательность и увлечение как основа эмоционального фона занятия;

создание условий для общения учащихся как основы внутренней мотивации к учению;

уважительное отношение к детскому знанию и незнанию;

оценка не только знаний, но и стремления к ним, находчивости;

Цель– создание условий для формирования склонности обучающихся для самостоятельного приобретение недостающих знаний из разных источников эффективного использования ресурсов ДОД .

Задачи:

Образовательные: (ориентированные на достижение предметных результатов):

—развивать самостоятельность при ведении учебно-познавательной деятельности.

— знакомить с многообразием микроскопов, устройством и правилами работы с ними (на примере цифрового микроскопа).

— обучать технике изготовления микропрепаратов; способам фиксирования результатов наблюдений в виде фото и видео, выполненных с помощью цифрового микроскопа.

— сформировать у школьников представление о принципах функционирования микроскопа и об основных методах микроскопирования;

Развивающие: (ориентированные на метапредметные результаты образования):

— развить способности аналитически мыслить, сравнивать, обобщать, классифицировать изучаемую информацию;

-формировать навык работы со справочной научной и научно — популярной литературой (поиск и отбор необходимого материала).

— развивать у обучающихся представления и понятий об объектах и явлениях окружающего мира (неживой и живой природы, а также предметах, изготовленных людьми) в процессе работы с цифровым микроскопом.

Воспитательные: (ориентированные на личностные результаты):

— воспитание бережного отношения к природе через осознание неповторимости и своеобразия природных объектов и явлений в процессе их изучения с помощью микроскопа.

— развитие эмоциональной сферы и восприятия, сохранение чувства удивления, восхищения открывающимися гранями красоты природы при созерцании микромира

Техника приготовления временных микропрепаратов

   Видео лекция  » Приготовление временных препаратов»

         https://youtu.be/OsQOzjdUzIM

    Видео лекция  «Приготовление фиксированных препаратов»

• Практический материал «Техника приготовления временных микропрепаратов»​​​​​​​

Задание для индивидуальной работы​​​​​​​​​​​​​​

Микроскопы открывают крохотные миры. С помощью микроскопа можно увидеть невероятный мир, существующий на клеточном уровне. Поразительным свойством микропрепаратов является возможность их длительного хранения и наблюдения распада клеток с течением времени. В любом случае, если не терпится поскорее взглянуть на образец или проводится долгое научное исследование, нужно научиться приготавливать микропрепараты.

Приготовление сухого препарата

Сухие препараты используются для изучения образцов, не требующих для выживания контакта с водой. Для начала потребуется чистое предметное стекло. Осторожно поместите как можно более тонкий срез образца в центр предметного стекла и накройте его покровным стеклом. Если вы в резиновых перчатках, можете слегка придавить покровное стекло, чтобы выровнять препарат.

Приготовление влажного препарата

Влажные препараты используются, если образец не может обходиться без воды, чтобы оставаться живым. Это часто бывает с одноклеточными организмами и мелкими животными. Возьмите чистое предметное стекло. С помощью пипетки, поместите одну-две капли дистиллированной воды в центр стекла. Поместите в воду образец и накройте его покровным стеклом. Опять же, можно немного прижать покровное стекло, если на руках резиновые перчатки. Прикосновение к стеклу без перчаток оставит на нем отпечатки, мешающие наблюдениям препарата под микроскопом.

Влажные препараты сами по себе удерживают покровное стекло на месте и могут храниться некоторое время. Если исследуемые микроорганизмы слишком подвижны, чтобы их можно было изучать, «замедлить» их, добавив в воду связующий компонент, например «Protoslo» (1,5% раствор метилцеллюлозы).

Подкрашивание препаратов

Некоторые организмы трудно увидеть под микроскопом без дополнительного окрашивания. Лучший способ это сделать – добавить капельку раствора Люголя (раствор йода и йодида калия) в воду перед тем, как поместить в нее образец. Также можно использовать растворы «метиленового синего» или «кристаллического фиолетового».

Если требуется окрасить уже готовый препарат , можно попробовать такую хитрость. Поместите с одной стороны покровного стекла краситель, а с другой – бумажную салфетку. Салфетка будет вытягивать влагу из-под стекла с  одной стороны и таким образом затягивать под него краситель с другой стороны.

 Видео лекция  » Приготовление временных препаратов»

Рекомендации по изготовлению временных микропрепаратов
и выполнению биологического рисунка

Правила приготовления микропрепаратов

Техника приготовления временных микропрепаратов

1. Микропрепараты готовят путем помещения объектов в каплю воды на предметном стекле, тщательно расправляя их с помощью препаровальных игл
и накрывая покровным стеклом. Избыток воды удаляется фильтровальной бумагой.

2. Приготовленный препарат рассматривается вначале при малом (×8, ×20),
а затем при большом (×40, ×60, ×90 с иммерсией) увеличении микроскопа с осветителем. При использовании иммерсионной системы микроскопа на препарат наносят каплю кедрового масла и рассматривают без покровного стекла.

3. Рассматриваемые объекты зарисовываются и подписываются.

4. Узнать увеличение микроскопа, при котором рассматривается тот или иной объект, просто. Для этой цели необходимо умножить цифру, стоящую на объективе, на цифру, обозначенную на окуляре (эта цифра всегда со знаком ×). Например, при объективе 40 и окуляре ×10, микроскоп дает увеличение в 400 раз.

Техника выполнения биологического рисунка

Зарисовке ботанических объектов нужно уделять серьезное внимание, так как это не только способ оформления результатов наблюдения, но и метод эксперимента, позволяющий более детально изучить объект.

1. Рисунок должен быть четким, пропорциональным, правильно отражать результаты наблюдений, трактовку исследованных структур.

2. Схему строения таллома рисуют при малом, а детальное строение отдельных клеток при большом увеличении микроскопа.

3. Располагают рисунок с левой стороны листа.

4. На правую сторону выносят стрелки с цифрами и расшифровывают их
в подрисуночной подписи.

5. Рисунок должен быть крупным (не более двух на листе). Делают его простым карандашом.

  Видео лекция  «Приготовление фиксированных препаратов»

Приготовление фиксированных окрашенных препаратов включает следующие этапы: приготовление мазка, высушивание, фиксацию и окраску.

1. Приготовление мазка. На обезжиренное спиртом предметное стекло помещают маленькую каплю водопроводной воды и переносят в нее петлей небольшое количество исследуемого материала как для препарата «раздавленная капля». Полученную суспензию равномерно размазывают петлей на площади 1 — 2 см2 возможно более тонким слоем. Мазок должен быть настолько тонок, чтобы высыхал после приготовления.
2. Высушивание мазка. Лучше всего сушить готовый препарат при комнатной температуре на воздухе. Хорошо приготовленный тонкий мазок высыхает быстро. Если высушивание мазка замедлено, то препарат можно слегка нагреть в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Эту операцию следует проводить осторожно, не перегревая мазка, иначе клетки микроорганизмов деформируются.

3. Фиксация препарата преследует несколько целей: убить микроорганизмы, то есть сделать безопасным дальнейшее обращение с ними; обес печить лучшее прилипание клеток к стеклу; сделать мазок более восприимчивым к окраске, так как мертвые клетки окрашиваются лучше, чем живые. Самым распространенным способом фиксации является термическая обработка. Для этого препарат трижды проводят через наиболее горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. Не следует перегревать мазок, так как при этом происходят грубые изменения клеточных структур, а иногда и внешнего вида клеток, например их сморщивание. Для исследования тонкого строения клетки прибегают к фиксации различными химическими веществами. Фиксирующую жидкость наливают на мазок, либо препарат на определенное время погружают в стакан с фиксатором.

4. Окраска. Клетки микроорганизмов окрашивают главным образом анилиновыми красителями. Различают простые и дифференциальные спо собы окрашивания микроорганизмов. При простой окраске прокрашивается вся клетка, так что становятся хорошо видны ее форма и размеры. Дифференциальная окраска предполагает окрашивание не всей клетки, а опре деленных ее структур. С помощью дифференциальной окраски выявляют некоторые клеточные структуры и запасные вещества. Для простого окрашивания клеток микроорганизмов чаще всего пользуются фуксином, генциановым фиолетовым, метиленовым синим. Для получения более чистых препаратов краситель наливают на мазок, покрытый фильтровальной бумагой.

Метод окрашивания в модификации

Синева позволяет использовать вместо растворов красителей фильтровальную бумагу, заранее пропитанную красителем. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки микроорганизмов. Фиксированные, окрашенные препараты могут храниться длительное время. Необходимо помнить, что возраст культуры, состав среды и условия культивирования существенно влияют на морфологию и цитологию микроорганизмов.

Практический материал «Техника приготовления временных препаратов»

Задание 1. Ознакомление с лабораторным оборудованием, применяемом при работе с микроскопом.

Ознакомьтесь с назначением лабораторного оборудования, применяе- мого при работе с микроскопом: микротомом, предметными и покровными стеклами, пинцетом, пипеткой, препаровальной иглой и др.

Задание 2. Освоение техники приготовления временных препаратов.

Изготовьте препарат эпидермы (кожицы) сочной чешуи луковицы лука. Для правильного выполнения задания используйте литературу для учащихся [2, 3], презентацию лекции «Продолжим знакомство с микроско- пом».

Найдите и рассмотрите при малом увеличении участок эпидермы, со- стоящий из одного слоя клеток с хорошо заметными ядрами (используйте нижнюю подсветку микроскопа). Изучите строение клетки при большом увеличении.

Задание 3. Выводы по занятию.

Литература для педагога

Приготовление микропрепаратов. https://www.4glaza.ru/articles/about_kits_for_experimenting/

Лабораторный практикум по зоологии позвоночных: Учеб. пособие для студ. высш. учеб. зав. / В.М. Константинов, С.П.Шаталова, В.Г.Бабенко и др. / Под ред. В.М.Константинова. — М.: Академия, 2004. — 272 с.

Практикум по систематике растений и грибов: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / А.Г.Еленевский, М.П.Соловьева, Н.М.Ключникова и др.; Под ред. А.Г.Еленевского. — М.: Академия, 2004. — 160 с.

Степанян, Е.Н. Лабораторные занятия по зоологии с основами экологии: Учеб. пособие для студ. высш. пед учеб. заведений. / Е.Н.Степанян, Е.М. Алексахина. — М.: Академия, 2001. — 120 с.

Шарова, И.Х. Зоология беспозвоночных: Учеб. для студ. высш. учеб. заведений / И.Х. Шарова. — М.: Гуманит. изд. центр ВЛАДОС, 2002. — 592с.

Хржановский, В.Г. Практикум по курсу общей ботаники: Учеб. пособие. / В.Г.Хржановский, С.Ф Пономарева. — М.: Высш. школа, 1979. — 422 с.

Литература для учащихся и учебная литература

Гуриков В.А. Становление прикладной оптики / В.А.Гуриков. — М.: Наука, 1983 — 188с.

Мазур, О. Ч. Невидимый мир / О. Ч. Мазур., 2015. — 96с.

Мазур, О.Ч. Удивительный микроскоп. Иллюстрированный путеводитель / О.Ч.Мазур. — М.Эксмо, 2018 — 96с.

Толанский, С. Революция в оптике / С.Толанский. — М.: Мир, 1971- 223 с.

Литература для родителей:

Мазур, О. Ч. Невидимый мир / О. Ч. Мазур. 2015. -96с.

Толанский, С. Революция в оптике / С.Толанский. — М.: Мир, 1971­223 с.

Информационно-коммуникативные технологии познания окружающего мира в начальной школе (Цифровые средства наблюдения и фиксации в курсе «Окружающий мир») / авт.-сост. Т. Р. Кулиджи, В. В. Хрущева. — Новосибирск:, 2013.​​​​​​​